![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
Entry tags:
Выделение ВИЧ (Perth Group)
Perth Group - группа активных ВИЧ отрицателей (человек 6-8), основавшаяся в городе Перте в Западной Австралии. На нее часто ссылаются, как на авторитетных ученых, приводящих доказательства того, что ВИЧ не вызывает СПИД и вообще не существует. Потому что его не выделили. При этом они дают собственное определение термину "выделение", считая что микробиологи этот термин используют неправильно (показательно, что среди них нет ни одного вирусолога, зато есть 3-4 физика). Они много что пишут о ВИЧ, но основные их претензии к выделению ВИЧ приведены вот здесь: What exactly is wrong with the way HIV has been isolated?
В этом посте они фокусируются на статье Роберта Галло 1984 года в Science. Я ее выложил вот здесь. В статье показывается, что некий, неизвестный до тех пор, ретровирус обнаруживается в пациентах со СПИДом или с риском развития СПИДа, но не в здоровых людях не попадающих в группы риска. Для определения присутствия вируса (не обязательно выделения, а просто детекции) использовалось четыре критерия и если образец удовлетворял как минимум двум из этих четырех, то пациент считался зараженным ВИЧ. Пертская Группа критикует эти четыре критерия, давайте посмотрим на их претензии.
Критерий первый: Обратная транскрипция
Обратная транскрипция это процесс создания ДНК по матрице РНК. Этот процесс (редкий в остальном животном мире) является характерной чертой ретровирусов. Галло и соавторы считали, что обнаружение обратной транскрипции в культурах лимфоцитов является признаком присутствия ретровируса.
В Пертской Группе считают, что обнаружение обратной транскрипции в образцах из пациентов ни о чем не говорит. Дескать обратная транскриптаза бывает много у кого, не только у ретровирусов, поэтому обнаружение обратной транскриптазы не является доказательством присутствия ретровируса. Даже нормальные лимфоциты в определенных условиях продуцируют обратную транскриптазу, как показал сам Галло в 1973 году. Кроме того, нормальные клетки содержат ферменты, которые не являются обратной транскриптазой, но могут копировать РНК в ДНК.
В чем они правы: Действительно, обратную транскриптазу можно найти, например, в бактериях, поэтому доказательством присутствия ретровируса она не является. И действительно в нормальных клетках существуют ферменты, которые в некоторых случаях копируют РНК в ДНК.
В чем они не правы: Никто и не считает присутствие обратной транскриптазы абсолютным доказательством, это лишь один из критериев. В культуре нормальных лимфоцитов обратную транскриптазу не найти.
Основная же проблема в логике Пертской группы в том, что если нормальные лимфоциты продуцируют обратную транскриптазу, то в приведенных экспериментах она должна появляться в культуре лимфоцитов сразу и присутствовать постоянно. Однако это не так - на Fig.1 мы видим, что обратная транскриптаза обнаруживается в культуре лишь спустя 20 дней, потом исчезает и появляется вновь (иногда) лишь после добавления антител, ингибирующих антивирусный ответ клеток. Такая динамика согласуется с идеей о размножении вируса в культуре, с его последующим подавлением из-за вымирания клеток-мишеней и из-за запуска антивирусных механизмов. К сожалению, в статье не говорится в скольких случаях обратная транскрипция была обнаружена у пациентов со СПИДом и у здоровых людей (приводится лишь общее число людей с двумя и более положительными критериями). Но то, что в обычных лимфоцитах обратную транскриптазу не найти, было известно и тогда, и с тех пор тоже многократно подтверждено (я могу подтвердить на собственном опыте). Ссылка на Галло, якобы показавшего присутствие обратной транскриптазы в нормальных лимфоцитах, ведет на обзорную главу в книге, которая в интернете не доступна. Зато в интернете можно найти экспериментальные работы Галло 1973 года, в которых он показывает, что обычно лимфоциты не производят обратную транскриптазу, а производят ее только лимфоциты, трансформированные в раковые клетки. И в таких лимфоцитах находятся следы ретровирусов.
То есть, вопреки утверждениям Perth group, обратная транскриптаза таки является довольно специфичным указателем на присутствие ретровируса.
Критерий второй: Фотографии вирусных частиц
На электронных фотографиях культур лимфоцитов были обнаружены частицы, которые выглядят очень похоже на ретровирусы.
Пертская Группа возражает, что "похожий на ретровирус" не означает обязательно "ретровирус". Это может быть что-то еще. К тому же, Галло и Монтанье говорят о ретровирусах типа С, а ВИЧ не относится к типу С.
В чем они правы: "Похожий на ретровирус" не означает обязательно "ретровирус".
В чем они не правы: Как и в случае с обратной транскриптазой, никто и не утверждал, что обязательно означает. Именно поэтому для положительного диагноза в статье Галло является удовлетворение как минимум двух критериев. Если что-то выглядит как ретровирус и содержит в себе характерный для ретровирусов фермент - обратную транскриптазу, то это уже очень убедительный аргумент в пользу того, что мы имеем перед собой действительно ретровирус.
Относительно того, что ВИЧ не относится к "типу С": К "типу С" относятся ретровирусы, которые проходят сборку у плазматической мембраны клетки и на электронных фотографиях выглядят как плотное кольцо. ВИЧ на начальных стадиях сборки выглядит именно как "тип С" вирус, и именно об этом и написано в статьях Монтанье и Галло. Другое дело, что после отделения от клетки в структуре ВИЧ происходят изменения и он уже не выглядит как "тип С". В статье Галло этот факт отмечен, а в культурах Монтанье вируса было так мало, что они могли этого и не заметить.
Критерий третий: Инфекционность.
В первых двух критериях речь шла о культурах лимфоцитов, полученных прямо из больных пациентов. Теоретически возможно, что наблюдаемые обратная транскриптаза и странные вирусоподобные структуры в этих лимфоцитах являются не вирусом, а каким-то необычным свойством именно этих лимфоцитов. Галло и соавторы показывали инфекционную сущность данного феномена перенося к лимфоцитам из здоровых людей лишь отфильтрованную жидкость из образцов пациентов, не содержащую клеток. Появление обратной транскрипции и вирусных частиц в свежей культуре доказывает, что эти вещи вызываются именно вирусом.
Пертская Группа возражает, что... собственно, ничего конкретного они по данному поводу не говорят. Говорят "а вы не очистили эти частицы и не доказали, что это обратная транскриптаза появляется именно из этих частиц", что вообще никак не относится к данному критерию. Какая разница как именно очищены частицы и откуда именно берется обратная транскриптаза? Речь ведь идет о том, что что-бы ни вызывало эти вещи, оно инфекционно и проходит через очень мелкие фильтры и вызывает их в здоровых лимфоцитах, что указывает на вирусную природу.
В чем они правы: Да ни в чем.
В чем они не правы: Да во всём.
Критерий четвертый: Вирусные белки
Небольшое отступление для тех, кто не знает, что такое Вестерн блот: Если собрать клетки, разрушить их, специальным образом обработать и прогнать получившийся материал через гель, то все клеточные белки выстроятся в очередь по размеру - мелкие белки будут двигаться быстро и убегут дальше всех, большие белки будут с трудом проходить через поры геля и сдвинутся с начального места лишь немного. Разделенные таким образом белки можно покрасить неспецифичной краской и увидеть все сразу, а можно использовать антитела и тогда видны будут только белки, которые специфично распознаются используемыми антителами. Например, если взять антитела к белкам p53 и GFP, то из всех клеточных белков будут видны лишь белки p53 и GFP (если они в этих клетках есть). Если взять сыворотку крови из человека, переболевшего корью, то в ней будут антитела к вирусу кори. Если эту сыворотку использовать для детекции белков на Вестерн-блоте, то для клеток из здорового человека (даже в прошлом переболевшего корью) мы не увидим ничего, а для клеток из человека больного корью мы увидим белки кори (потому что с ними будут реагировать антитела против вируса кори).
Галло и соавторы использовали сыворотку крови из одного больного СПИДом для детекции белков в образцах из других людей. Антитела из этой сыворотки связывались с несколькими белками из образцов больных людей, но не связывались с белками из здоровых людей. Что указывало на общую вирусную природу заболевания. Они также собирали фильтрат из культур лимфоцитов и использовали его для иммунизации кроликов. Сыворотка из кроликов тоже использовалась для детекции белков на Вестерн-блотах.
Возражения Пертской Группы: Вы не знаете что именно вызвало появление этих антител и с чем эти антитела связываются. Это может быть какой-то другой вирус, это может быть вообще аутоимунное заболевание, это может быть неспецифичное связывание антител.
В чем они правы: Во всём. Действительно не знаем, действительно может быть что угодно.
В чем они не правы: Несмотря на то, что в каждом конкретном случае полученный результат может быть ошибочным, сумма всех проведенных анализов лучше всего объясняется именно присутствием вируса.
Пертская Группа не приводит никакой теории, которая смогла бы иначе объяснить появление положительного сигнала в больных людях и его отсутствие в здоровых, а также идентичный набор белков, детектируемый в разных пациентах, а также результаты полученные с сывороткой из кроликов. Все, что они могут сказать: "Это может быть и не вирус, но мы не знаем что именно". Как ученые они должны были бы предложить альтернативное объяснение и/или провести дополнительные эксперименты, которые бы подтвердили его. Они этого не сделали.
Итоги
В науке не бывает абсолютных доказательств. Мы делаем эксперименты, собираем данные, и взвешиваем насколько они совпадают с той или иной гипотезой. Если статья Монтанье сделала вирусную природу СПИДа вполне вероятной гипотезой и предложила возможный вирус, отвечающий за него, то результаты представленные в статье Галло значительно укрепили эту теорию и убедили практически всех вирусологов в том, что за СПИД отвечает новый ретровирус, названный позднее ВИЧ. Комбинация "обратная транскрипция + вирусные частицы + инфекционность + белки, детектируемые антителами" обнаруживаемая в людях больных СПИДом или находящихся в группах риска, но не обнаруживаемая в здоровых людях лучше всего объясняется именно присутствием ретровируса. Пертская Группа критикует отдельные части работы Галло, некоторые их претензии даже имеют смысл, но эта работа так элегантно сделана, что все ее части подтверждают друг друга.
Что особенно ставит под удар аргументы Пертской Группы, так это то, что все слабые звенья в работе Галло, которые они ставят под сомнения, с тех пор были неоднократно и совершенно неопровержимо подтверждены. Например, геном ВИЧ, заклонированный в плазмиды, был очищен идеально и при его введении в клетки появляются инфекционные частицы с обратной транскриптазой. А белки, которые обнаруживались на Галло на Вестерн-блотах и про которые Пертская Группа говорит, что они могут быть чем угодно - тоже были клонированы и наработаны отдельно от вируса и их природа была подтверждена. И т.д. и т.п. Прогресс последних 25-30 лет в изучении ВИЧ подтвердил и объяснил все, что Галло и Монанье наблюдали в своих экспериментах в 1983-84 годах.
В этом посте они фокусируются на статье Роберта Галло 1984 года в Science. Я ее выложил вот здесь. В статье показывается, что некий, неизвестный до тех пор, ретровирус обнаруживается в пациентах со СПИДом или с риском развития СПИДа, но не в здоровых людях не попадающих в группы риска. Для определения присутствия вируса (не обязательно выделения, а просто детекции) использовалось четыре критерия и если образец удовлетворял как минимум двум из этих четырех, то пациент считался зараженным ВИЧ. Пертская Группа критикует эти четыре критерия, давайте посмотрим на их претензии.
Критерий первый: Обратная транскрипция
Обратная транскрипция это процесс создания ДНК по матрице РНК. Этот процесс (редкий в остальном животном мире) является характерной чертой ретровирусов. Галло и соавторы считали, что обнаружение обратной транскрипции в культурах лимфоцитов является признаком присутствия ретровируса.
В Пертской Группе считают, что обнаружение обратной транскрипции в образцах из пациентов ни о чем не говорит. Дескать обратная транскриптаза бывает много у кого, не только у ретровирусов, поэтому обнаружение обратной транскриптазы не является доказательством присутствия ретровируса. Даже нормальные лимфоциты в определенных условиях продуцируют обратную транскриптазу, как показал сам Галло в 1973 году. Кроме того, нормальные клетки содержат ферменты, которые не являются обратной транскриптазой, но могут копировать РНК в ДНК.
В чем они правы: Действительно, обратную транскриптазу можно найти, например, в бактериях, поэтому доказательством присутствия ретровируса она не является. И действительно в нормальных клетках существуют ферменты, которые в некоторых случаях копируют РНК в ДНК.
В чем они не правы: Никто и не считает присутствие обратной транскриптазы абсолютным доказательством, это лишь один из критериев. В культуре нормальных лимфоцитов обратную транскриптазу не найти.
Основная же проблема в логике Пертской группы в том, что если нормальные лимфоциты продуцируют обратную транскриптазу, то в приведенных экспериментах она должна появляться в культуре лимфоцитов сразу и присутствовать постоянно. Однако это не так - на Fig.1 мы видим, что обратная транскриптаза обнаруживается в культуре лишь спустя 20 дней, потом исчезает и появляется вновь (иногда) лишь после добавления антител, ингибирующих антивирусный ответ клеток. Такая динамика согласуется с идеей о размножении вируса в культуре, с его последующим подавлением из-за вымирания клеток-мишеней и из-за запуска антивирусных механизмов. К сожалению, в статье не говорится в скольких случаях обратная транскрипция была обнаружена у пациентов со СПИДом и у здоровых людей (приводится лишь общее число людей с двумя и более положительными критериями). Но то, что в обычных лимфоцитах обратную транскриптазу не найти, было известно и тогда, и с тех пор тоже многократно подтверждено (я могу подтвердить на собственном опыте). Ссылка на Галло, якобы показавшего присутствие обратной транскриптазы в нормальных лимфоцитах, ведет на обзорную главу в книге, которая в интернете не доступна. Зато в интернете можно найти экспериментальные работы Галло 1973 года, в которых он показывает, что обычно лимфоциты не производят обратную транскриптазу, а производят ее только лимфоциты, трансформированные в раковые клетки. И в таких лимфоцитах находятся следы ретровирусов.
То есть, вопреки утверждениям Perth group, обратная транскриптаза таки является довольно специфичным указателем на присутствие ретровируса.
Критерий второй: Фотографии вирусных частиц
На электронных фотографиях культур лимфоцитов были обнаружены частицы, которые выглядят очень похоже на ретровирусы.
Пертская Группа возражает, что "похожий на ретровирус" не означает обязательно "ретровирус". Это может быть что-то еще. К тому же, Галло и Монтанье говорят о ретровирусах типа С, а ВИЧ не относится к типу С.
В чем они правы: "Похожий на ретровирус" не означает обязательно "ретровирус".
В чем они не правы: Как и в случае с обратной транскриптазой, никто и не утверждал, что обязательно означает. Именно поэтому для положительного диагноза в статье Галло является удовлетворение как минимум двух критериев. Если что-то выглядит как ретровирус и содержит в себе характерный для ретровирусов фермент - обратную транскриптазу, то это уже очень убедительный аргумент в пользу того, что мы имеем перед собой действительно ретровирус.
Относительно того, что ВИЧ не относится к "типу С": К "типу С" относятся ретровирусы, которые проходят сборку у плазматической мембраны клетки и на электронных фотографиях выглядят как плотное кольцо. ВИЧ на начальных стадиях сборки выглядит именно как "тип С" вирус, и именно об этом и написано в статьях Монтанье и Галло. Другое дело, что после отделения от клетки в структуре ВИЧ происходят изменения и он уже не выглядит как "тип С". В статье Галло этот факт отмечен, а в культурах Монтанье вируса было так мало, что они могли этого и не заметить.
Критерий третий: Инфекционность.
В первых двух критериях речь шла о культурах лимфоцитов, полученных прямо из больных пациентов. Теоретически возможно, что наблюдаемые обратная транскриптаза и странные вирусоподобные структуры в этих лимфоцитах являются не вирусом, а каким-то необычным свойством именно этих лимфоцитов. Галло и соавторы показывали инфекционную сущность данного феномена перенося к лимфоцитам из здоровых людей лишь отфильтрованную жидкость из образцов пациентов, не содержащую клеток. Появление обратной транскрипции и вирусных частиц в свежей культуре доказывает, что эти вещи вызываются именно вирусом.
Пертская Группа возражает, что... собственно, ничего конкретного они по данному поводу не говорят. Говорят "а вы не очистили эти частицы и не доказали, что это обратная транскриптаза появляется именно из этих частиц", что вообще никак не относится к данному критерию. Какая разница как именно очищены частицы и откуда именно берется обратная транскриптаза? Речь ведь идет о том, что что-бы ни вызывало эти вещи, оно инфекционно и проходит через очень мелкие фильтры и вызывает их в здоровых лимфоцитах, что указывает на вирусную природу.
В чем они правы: Да ни в чем.
В чем они не правы: Да во всём.
Критерий четвертый: Вирусные белки
Небольшое отступление для тех, кто не знает, что такое Вестерн блот: Если собрать клетки, разрушить их, специальным образом обработать и прогнать получившийся материал через гель, то все клеточные белки выстроятся в очередь по размеру - мелкие белки будут двигаться быстро и убегут дальше всех, большие белки будут с трудом проходить через поры геля и сдвинутся с начального места лишь немного. Разделенные таким образом белки можно покрасить неспецифичной краской и увидеть все сразу, а можно использовать антитела и тогда видны будут только белки, которые специфично распознаются используемыми антителами. Например, если взять антитела к белкам p53 и GFP, то из всех клеточных белков будут видны лишь белки p53 и GFP (если они в этих клетках есть). Если взять сыворотку крови из человека, переболевшего корью, то в ней будут антитела к вирусу кори. Если эту сыворотку использовать для детекции белков на Вестерн-блоте, то для клеток из здорового человека (даже в прошлом переболевшего корью) мы не увидим ничего, а для клеток из человека больного корью мы увидим белки кори (потому что с ними будут реагировать антитела против вируса кори).
Галло и соавторы использовали сыворотку крови из одного больного СПИДом для детекции белков в образцах из других людей. Антитела из этой сыворотки связывались с несколькими белками из образцов больных людей, но не связывались с белками из здоровых людей. Что указывало на общую вирусную природу заболевания. Они также собирали фильтрат из культур лимфоцитов и использовали его для иммунизации кроликов. Сыворотка из кроликов тоже использовалась для детекции белков на Вестерн-блотах.
Возражения Пертской Группы: Вы не знаете что именно вызвало появление этих антител и с чем эти антитела связываются. Это может быть какой-то другой вирус, это может быть вообще аутоимунное заболевание, это может быть неспецифичное связывание антител.
В чем они правы: Во всём. Действительно не знаем, действительно может быть что угодно.
В чем они не правы: Несмотря на то, что в каждом конкретном случае полученный результат может быть ошибочным, сумма всех проведенных анализов лучше всего объясняется именно присутствием вируса.
Пертская Группа не приводит никакой теории, которая смогла бы иначе объяснить появление положительного сигнала в больных людях и его отсутствие в здоровых, а также идентичный набор белков, детектируемый в разных пациентах, а также результаты полученные с сывороткой из кроликов. Все, что они могут сказать: "Это может быть и не вирус, но мы не знаем что именно". Как ученые они должны были бы предложить альтернативное объяснение и/или провести дополнительные эксперименты, которые бы подтвердили его. Они этого не сделали.
Итоги
В науке не бывает абсолютных доказательств. Мы делаем эксперименты, собираем данные, и взвешиваем насколько они совпадают с той или иной гипотезой. Если статья Монтанье сделала вирусную природу СПИДа вполне вероятной гипотезой и предложила возможный вирус, отвечающий за него, то результаты представленные в статье Галло значительно укрепили эту теорию и убедили практически всех вирусологов в том, что за СПИД отвечает новый ретровирус, названный позднее ВИЧ. Комбинация "обратная транскрипция + вирусные частицы + инфекционность + белки, детектируемые антителами" обнаруживаемая в людях больных СПИДом или находящихся в группах риска, но не обнаруживаемая в здоровых людях лучше всего объясняется именно присутствием ретровируса. Пертская Группа критикует отдельные части работы Галло, некоторые их претензии даже имеют смысл, но эта работа так элегантно сделана, что все ее части подтверждают друг друга.
Что особенно ставит под удар аргументы Пертской Группы, так это то, что все слабые звенья в работе Галло, которые они ставят под сомнения, с тех пор были неоднократно и совершенно неопровержимо подтверждены. Например, геном ВИЧ, заклонированный в плазмиды, был очищен идеально и при его введении в клетки появляются инфекционные частицы с обратной транскриптазой. А белки, которые обнаруживались на Галло на Вестерн-блотах и про которые Пертская Группа говорит, что они могут быть чем угодно - тоже были клонированы и наработаны отдельно от вируса и их природа была подтверждена. И т.д. и т.п. Прогресс последних 25-30 лет в изучении ВИЧ подтвердил и объяснил все, что Галло и Монанье наблюдали в своих экспериментах в 1983-84 годах.