Выделение ВИЧ (Perth Group)

[shvarz]

Perth Group - группа активных ВИЧ отрицателей (человек 6-8), основавшаяся в городе Перте в Западной Австралии. На нее часто ссылаются, как на авторитетных ученых, приводящих доказательства того, что ВИЧ не вызывает СПИД и вообще не существует. Потому что его не выделили. При этом они дают собственное определение термину "выделение", считая что микробиологи этот термин используют неправильно (показательно, что среди них нет ни одного вирусолога, зато есть 3-4 физика). Они много что пишут о ВИЧ, но основные их претензии к выделению ВИЧ приведены вот здесь: What exactly is wrong with the way HIV has been isolated?

В этом посте они фокусируются на статье Роберта Галло 1984 года в Science. Я ее выложил вот здесь. В статье показывается, что некий, неизвестный до тех пор, ретровирус обнаруживается в пациентах со СПИДом или с риском развития СПИДа, но не в здоровых людях не попадающих в группы риска. Для определения присутствия вируса (не обязательно выделения, а просто детекции) использовалось четыре критерия и если образец удовлетворял как минимум двум из этих четырех, то пациент считался зараженным ВИЧ. Пертская Группа критикует эти четыре критерия, давайте посмотрим на их претензии.

Критерий первый: Обратная транскрипция
Обратная транскрипция это процесс создания ДНК по матрице РНК. Этот процесс (редкий в остальном животном мире) является характерной чертой ретровирусов. Галло и соавторы считали, что обнаружение обратной транскрипции в культурах лимфоцитов является признаком присутствия ретровируса.

В Пертской Группе считают, что обнаружение обратной транскрипции в образцах из пациентов ни о чем не говорит. Дескать обратная транскриптаза бывает много у кого, не только у ретровирусов, поэтому обнаружение обратной транскриптазы не является доказательством присутствия ретровируса. Даже нормальные лимфоциты в определенных условиях продуцируют обратную транскриптазу, как показал сам Галло в 1973 году. Кроме того, нормальные клетки содержат ферменты, которые не являются обратной транскриптазой, но могут копировать РНК в ДНК.

В чем они правы: Действительно, обратную транскриптазу можно найти, например, в бактериях, поэтому доказательством присутствия ретровируса она не является. И действительно в нормальных клетках существуют ферменты, которые в некоторых случаях копируют РНК в ДНК.

В чем они не правы: Никто и не считает присутствие обратной транскриптазы абсолютным доказательством, это лишь один из критериев. В культуре нормальных лимфоцитов обратную транскриптазу не найти.

Основная же проблема в логике Пертской группы в том, что если нормальные лимфоциты продуцируют обратную транскриптазу, то в приведенных экспериментах она должна появляться в культуре лимфоцитов сразу и присутствовать постоянно. Однако это не так - на Fig.1 мы видим, что обратная транскриптаза обнаруживается в культуре лишь спустя 20 дней, потом исчезает и появляется вновь (иногда) лишь после добавления антител, ингибирующих антивирусный ответ клеток. Такая динамика согласуется с идеей о размножении вируса в культуре, с его последующим подавлением из-за вымирания клеток-мишеней и из-за запуска антивирусных механизмов. К сожалению, в статье не говорится в скольких случаях обратная транскрипция была обнаружена у пациентов со СПИДом и у здоровых людей (приводится лишь общее число людей с двумя и более положительными критериями). Но то, что в обычных лимфоцитах обратную транскриптазу не найти, было известно и тогда, и с тех пор тоже многократно подтверждено (я могу подтвердить на собственном опыте). Ссылка на Галло, якобы показавшего присутствие обратной транскриптазы в нормальных лимфоцитах, ведет на обзорную главу в книге, которая в интернете не доступна. Зато в интернете можно найти экспериментальные работы Галло 1973 года, в которых он показывает, что обычно лимфоциты не производят обратную транскриптазу, а производят ее только лимфоциты, трансформированные в раковые клетки. И в таких лимфоцитах находятся следы ретровирусов.

То есть, вопреки утверждениям Perth group, обратная транскриптаза таки является довольно специфичным указателем на присутствие ретровируса.

Критерий второй: Фотографии вирусных частиц
На электронных фотографиях культур лимфоцитов были обнаружены частицы, которые выглядят очень похоже на ретровирусы.

Пертская Группа возражает, что "похожий на ретровирус" не означает обязательно "ретровирус". Это может быть что-то еще. К тому же, Галло и Монтанье говорят о ретровирусах типа С, а ВИЧ не относится к типу С.

В чем они правы: "Похожий на ретровирус" не означает обязательно "ретровирус".

В чем они не правы: Как и в случае с обратной транскриптазой, никто и не утверждал, что обязательно означает. Именно поэтому для положительного диагноза в статье Галло является удовлетворение как минимум двух критериев. Если что-то выглядит как ретровирус и содержит в себе характерный для ретровирусов фермент - обратную транскриптазу, то это уже очень убедительный аргумент в пользу того, что мы имеем перед собой действительно ретровирус.

Относительно того, что ВИЧ не относится к "типу С": К "типу С" относятся ретровирусы, которые проходят сборку у плазматической мембраны клетки и на электронных фотографиях выглядят как плотное кольцо. ВИЧ на начальных стадиях сборки выглядит именно как "тип С" вирус, и именно об этом и написано в статьях Монтанье и Галло. Другое дело, что после отделения от клетки в структуре ВИЧ происходят изменения и он уже не выглядит как "тип С". В статье Галло этот факт отмечен, а в культурах Монтанье вируса было так мало, что они могли этого и не заметить.

Критерий третий: Инфекционность.
В первых двух критериях речь шла о культурах лимфоцитов, полученных прямо из больных пациентов. Теоретически возможно, что наблюдаемые обратная транскриптаза и странные вирусоподобные структуры в этих лимфоцитах являются не вирусом, а каким-то необычным свойством именно этих лимфоцитов. Галло и соавторы показывали инфекционную сущность данного феномена перенося к лимфоцитам из здоровых людей лишь отфильтрованную жидкость из образцов пациентов, не содержащую клеток. Появление обратной транскрипции и вирусных частиц в свежей культуре доказывает, что эти вещи вызываются именно вирусом.

Пертская Группа возражает, что... собственно, ничего конкретного они по данному поводу не говорят. Говорят "а вы не очистили эти частицы и не доказали, что это обратная транскриптаза появляется именно из этих частиц", что вообще никак не относится к данному критерию. Какая разница как именно очищены частицы и откуда именно берется обратная транскриптаза? Речь ведь идет о том, что что-бы ни вызывало эти вещи, оно инфекционно и проходит через очень мелкие фильтры и вызывает их в здоровых лимфоцитах, что указывает на вирусную природу.

В чем они правы: Да ни в чем.

В чем они не правы: Да во всём.

Критерий четвертый: Вирусные белки
Небольшое отступление для тех, кто не знает, что такое Вестерн блот: Если собрать клетки, разрушить их, специальным образом обработать и прогнать получившийся материал через гель, то все клеточные белки выстроятся в очередь по размеру - мелкие белки будут двигаться быстро и убегут дальше всех, большие белки будут с трудом проходить через поры геля и сдвинутся с начального места лишь немного. Разделенные таким образом белки можно покрасить неспецифичной краской и увидеть все сразу, а можно использовать антитела и тогда видны будут только белки, которые специфично распознаются используемыми антителами. Например, если взять антитела к белкам p53 и GFP, то из всех клеточных белков будут видны лишь белки p53 и GFP (если они в этих клетках есть). Если взять сыворотку крови из человека, переболевшего корью, то в ней будут антитела к вирусу кори. Если эту сыворотку использовать для детекции белков на Вестерн-блоте, то для клеток из здорового человека (даже в прошлом переболевшего корью) мы не увидим ничего, а для клеток из человека больного корью мы увидим белки кори (потому что с ними будут реагировать антитела против вируса кори).

Галло и соавторы использовали сыворотку крови из одного больного СПИДом для детекции белков в образцах из других людей. Антитела из этой сыворотки связывались с несколькими белками из образцов больных людей, но не связывались с белками из здоровых людей. Что указывало на общую вирусную природу заболевания. Они также собирали фильтрат из культур лимфоцитов и использовали его для иммунизации кроликов. Сыворотка из кроликов тоже использовалась для детекции белков на Вестерн-блотах.

Возражения Пертской Группы: Вы не знаете что именно вызвало появление этих антител и с чем эти антитела связываются. Это может быть какой-то другой вирус, это может быть вообще аутоимунное заболевание, это может быть неспецифичное связывание антител.

В чем они правы: Во всём. Действительно не знаем, действительно может быть что угодно.

В чем они не правы: Несмотря на то, что в каждом конкретном случае полученный результат может быть ошибочным, сумма всех проведенных анализов лучше всего объясняется именно присутствием вируса.

Пертская Группа не приводит никакой теории, которая смогла бы иначе объяснить появление положительного сигнала в больных людях и его отсутствие в здоровых, а также идентичный набор белков, детектируемый в разных пациентах, а также результаты полученные с сывороткой из кроликов. Все, что они могут сказать: "Это может быть и не вирус, но мы не знаем что именно". Как ученые они должны были бы предложить альтернативное объяснение и/или провести дополнительные эксперименты, которые бы подтвердили его. Они этого не сделали.

Итоги

В науке не бывает абсолютных доказательств. Мы делаем эксперименты, собираем данные, и взвешиваем насколько они совпадают с той или иной гипотезой. Если статья Монтанье сделала вирусную природу СПИДа вполне вероятной гипотезой и предложила возможный вирус, отвечающий за него, то результаты представленные в статье Галло значительно укрепили эту теорию и убедили практически всех вирусологов в том, что за СПИД отвечает новый ретровирус, названный позднее ВИЧ. Комбинация "обратная транскрипция + вирусные частицы + инфекционность + белки, детектируемые антителами" обнаруживаемая в людях больных СПИДом или находящихся в группах риска, но не обнаруживаемая в здоровых людях лучше всего объясняется именно присутствием ретровируса. Пертская Группа критикует отдельные части работы Галло, некоторые их претензии даже имеют смысл, но эта работа так элегантно сделана, что все ее части подтверждают друг друга.

Что особенно ставит под удар аргументы Пертской Группы, так это то, что все слабые звенья в работе Галло, которые они ставят под сомнения, с тех пор были неоднократно и совершенно неопровержимо подтверждены. Например, геном ВИЧ, заклонированный в плазмиды, был очищен идеально и при его введении в клетки появляются инфекционные частицы с обратной транскриптазой. А белки, которые обнаруживались на Галло на Вестерн-блотах и про которые Пертская Группа говорит, что они могут быть чем угодно - тоже были клонированы и наработаны отдельно от вируса и их природа была подтверждена. И т.д. и т.п. Прогресс последних 25-30 лет в изучении ВИЧ подтвердил и объяснил все, что Галло и Монанье наблюдали в своих экспериментах в 1983-84 годах.

Comments

[may-k.livejournal.com]

Спасибо, что разложили по полочкам!)

[may-k.livejournal.com]

PS: Чтобы не было так грустно за отсутствием картинок, могу развеселить рисунками белков.:)

HIV Protease (два ракурса)


Core Domain of GP120

[metarattus.livejournal.com]

>в людях
>в бактериях

Хе. Хехе. Интересно наблюдать в real-time, как у эмигранта утрачивается чувство языка.
Для хтоничного рашкованина такое написание выглядит с одной стороны явно коряво, а с другой даже как-то цынично.
Однако для того, чтобы появилась полубессознательная тяга к такому напейсанию не обязательно эмигрировать - достаточно просто например вплотную заниматься чтением пабмедовъ, как это происходит с ВПС.
Более того: ВПС, как убежденный языковой ригорист (но не граммарнаци!), антигуманист и "просто ненавистник всего русского" считает такое написание несравненно более правильным, чем лицемерное "у".
Такие дела.

[chyyr.livejournal.com]

Спасибо, очень интересно!

PS
А "Группа Перта" - это устоявшийся перевод?
Просто подумалось, что их лучше называть "Пертской Группой" - иначе создается ощущение, что Перт - это их лидер, а вовсе не город, в котором они живут

[metarattus.livejournal.com]

Мы, кстате, так и подумал.
Вот еще одно свидетельство частичной потери у автора чувства языка, Нами не замеченное.

[shvarz.livejournal.com]

Спасибо, поправил.

[rsokolov.livejournal.com]

Я тоже долгое время недоумевал, кто такой Виши.

[polryby3.livejournal.com]

Спасибо!

[etoile_verte]

Заинтересовало упоминание ретровирусов и рака в одном абзаце, но в статье про лимфому на википедии ничего найти не удалось :(

Исправьте использовалася на «использовалась», пожалуйста.
Я бы тоже не догадалась, что Перт не лидер.

[shvarz.livejournal.com]

http://en.wikipedia.org/wiki/Human_T-lymphotropic_virus

Спасибо, поправил и опечатку и Пертскую Группу.

[jeyushka.livejournal.com]

сейчас уже давно имеются специфические антитела к рекомбинантным белкам ВИЧ, товарищи из группы Перта имеют допотопное представление о биологии и отсутсвие системного понимания предмета.
Они лишь имеют влияние на такую же малообразованную в области соверемнной биологии общественность. В серьезных научных кругах отношение к Перту такое же, какое имеют историки к Фоменко, а именно как городскому сумасшедшему.

[shvarz.livejournal.com]

Да, именно так.

[lugermaxotto.livejournal.com]

Очень наглядно, спасибо. Уж одно к одному- есть ли доказательства, что это всё же вирус, а не прион? :)

[shvarz.livejournal.com]

Такого вопроса еще не слышал :)
Да, конечно это не прион. С прионами ВИЧ объединяет только то, что они проходят через фильтры меньше 200нм, в остальном это совершенно разные вещи, даже доказательств не надо.

[rusty-spur.livejournal.com]

В нем же РНК...

[spiritualape.livejournal.com]

Вы бы, чем издеваться над убогими, помогли им. Они ведь выбрали СПИД, просто потому, что он на слуху. Уверен, что Вам ничего не стоит надиктовать список из пары дюжин подобных лже-вирусов - люди скажут Вам спасибо :)

[dimcher dimcher (from livejournal.com)]

То есть ты на первой стадии принятия твоего диагноза - ОТРИЦАНИЕ. Ну дай Б-г чтоб ты быстрее до пятой дополз - ПРИНЯТИЕ и согласие пить что тебе инфекционист выпишет.

[kosiakk.livejournal.com]

Прям каменный век.

"два из четырёх" - как в лотерее. Есть же отличная Байесовская вероятность, которая точно и обоснованно показывает вероятность события, состоящего из нескольких под-событий.

Не все критерии одинакого убедительны и вероятны. Почему бы просто не посчитать итоговую вероятность - выйдет же наверняка что-то больше 80%.

И потом уже можно сколько угодно аргументированно спорить - ставить диагноз при 85% или 95% вероятности, например. Но без ереси хотя бы

[shvarz.livejournal.com]

Это статья 83 года. Как я читал недавно в одной книжке, в то время ересью считалась именно байесовская вероятность :)

[cryptopolicy.livejournal.com]

Однако это не так - на Fig.1 мы видим, что обратная транскриптаза обнаруживается в культуре лишь спустя 20 дней

На графике из работы "In Vivo and in Vitro Proteome Analysis of Human Immunodeficiency Virus (HIV)-1-infected, Human CD4+ T Cells"



мы видим 2 вещи:
1. Белок p24, считающийся специфичным для ВИЧ, появляется до заражения культуры вирусом, на этапе подготовки культуры, включающем стимулирование культуры
2. Никакой временной задержки нет, сразу после заражения наблюдается экспоненциальный рост кол-ва этого белка.
Всего на графике 48 часов.
Белка p24 больше в вирионах, чем обратной транскриптазы. Но кол-во RT прямо пропорционально кол-ву p24, поэтому в культуре имеет место экспоненциальный рост и RT.

Не могли бы вы:
1. Объяснить первый факт
2. Объяснить то, как второй факт коррелирует с работой Галло

[shvarz.livejournal.com]

1. А где вы видите, что p24 появляется до заражения культуры вирусом? Я вижу 0 в точке -24h, и что-то очень близкое к нулю в точке 0h - это видимо вирус, который нанесли на культуру для ее заражения.
2. Вы сравниваете суперчувствительный масс-спек в 2017 году с довольно рудиментарными методами детекции обратной транскрипции использовавшимися более 30 лет назад. Вы также сравниваете инфекцию обогащенных CD4 клеток активированных PHA и Oct3 сделанную спинокуляцией c инфекцией лимфоцитов активированных IL-2. Если бы у Галло были такие методики в 1984 году, он бы тоже увидел репликацию на следующий же день, а так их методики позволяли лишь ухватить самый верх экспоненты, почти перед тем, как репликация проваливалась вниз из-за того, что все клетки уже были инфицированы и начинали умирать.

[cryptopolicy.livejournal.com]

Критерий второй: Фотографии вирусных частиц

Пертская группа в том числе ссылается на исследование, в котором анализировалиись извлечения из лимфатической ткани доноров с лимфаденопатией. Было 2 группы, у первой тесты на ВИЧ давали плюс, у второй минус.

У 90 процентов доноров в обеих группах были обнаружены ВИЧ-подобные частицы:



В этом исследовании провели нормальный контроль. То есть для контроля использовались не здоровые доноры, а ВИЧ-отрицательные доноры, но с похожими проблемами со здоровьем. Вот и результат соответствующий.

[shvarz.livejournal.com]

Ссылку дайте пожалуйста, чтобы мне не тратить время на поиски.

[cryptopolicy.livejournal.com]

Критерий третий: Инфекционность.

Собственно, с доказательствами инфекционности в работе Галло не густо.

"The HTLV-Ill produced by cultured T cells from patients with AIDS and pre-AIDS is highly infectious and can bereadily transmitted to fresh umbilical cord blood and adult peripheral blood or bone marrow lymphocytes. The production of HTLV-III by these cells is transient, often declining to undetectable levels by 2 to 3 weeks after infection (data not shown)."

Это все про инфекционность из работы.

Мы читаем, что:
1. В неинфицированных изначально, затем инфицированных супернатантом, клетках продукция обратной транскриптазы снижается до неопределяемого уровня за 2-3 недели. То есть в тот момент, когда эта продукция в уже инфицированных только начала расти, согласно графику из работы.

Никто не видит в этом логическую нестыковку?

2. "can bereadily transmitted to fresh umbilical cord blood and adult peripheral blood or bone marrow lymphocytes"

То есть, супернатант добавлялся в
1. смесь пуповинной крови с периферической кровью

или в

2. смесь пуповинной крови с лимфоцитами костного мозга

Скажите, не была ли выявлена активность обратной транскриптазы, вызванная не экзогенными вирусами, в плаценте еще в 1979 году? А впоследствии подтверждена работами Spadafora, etc?
Не является ли активность эндогенных ретровирусов необходимым условием формирования плаценты?

[shvarz.livejournal.com]

Никто не видит в этом логическую нестыковку?
Нет, не вижу. Зависит от количества вируса в перенесенной жидкости. Если его там было дофига, то нет ничего удивительного в том, что зараженные этой жидкостью культуры быстрее прошли пик репликации вируса.

fresh umbilical cord blood and adult peripheral blood or bone marrow lymphocytes
Какая смесь? В кровь из пуповины и в лимфоциты из взрослой крови или из костного мозга.

выявлена активность обратной транскриптазы, вызванная не экзогенными вирусами, в плаценте еще в 1979 году? А впоследствии подтверждена работами Spadafora
Вы опять экстраполируете от одного экспримента к совершенно другому. Плацента и кровь из пуповины это же разные совершенно ткани.

Вы еще подумайте о следующем: В то время была масса экспертов, которые куда лучше нас с вами разбирались и в детекции ОТ в пуповине и в ее детекции в активированных лимфоцитах. Но никто из них почему то не посмотрел на эти данные Галло и не возмутился тем, что эксперимент поставлен неправильно и что так определять вирусы нельзя. Почему? Очевидный ответ - потому что эти эксперты знали где можно в отсутствие ретровируса детектировать ОТ, а где ее нет. Ваш ответ, я полагаю, будет строиться на какой-нибудь сложной конспирологической теории о том, что им всем угрожали или заплатили или еще что.

[shvarz.livejournal.com]

Вы выполнили условия для продолжения разговора? Если нет, то вы не можете тут больше общаться. Как обещал - буду сначала тереть ваши комменты, будете настаивать - забаню.

[cryptopolicy.livejournal.com]

В работе Монтанье очищенный центрифугированием вирус, выделенный из пациента BRU, не реагировал с антителами из сыворотки пациента BRU.



То есть к вирусу не вырабатывались антитела?

[shvarz.livejournal.com]

На вашей картинке видны очень тонкие полоски в линиях 1 и 2, но возможно это потому что я знаю куда смотреть. Когда я открываю исходный pdf, то их там видно чуть-чуть лучше. У меня есть перепечатка той статьи (не распечатка pdf, а перепечатка с гранок), там видно еще лучше, хотя полоски и тонкие. Так что это артефакт сканирования. Старые статьи сканировали машинами без особого контроля на качество, если вы найдете оригинал, то я думаю увидите и сами там полоски. В статье они прямо упоминаются, так что если бы их было не видно, то это бы заметили как рецензенты так и многочисленные читатели.

[nordickk.livejournal.com]

Спасибо! Еще один аргумент, что вирусов нет ))