shvarz | Entries tagged with история науки

Сборка новых вирусных частиц ВИЧ происходит следующим образом:

Вирусный белок Pr55gag полимеризуется в цитоплазме и его комплексы собираются рядом с клеточной мембраной. В эти комплексы включаются дополнительные вирусные белки и вирусная РНК. В мембрану встраивается белок оболочки. Вся эта компания постепенно выпучивается наружу, так что в конце концов остается лишь небольшой мостик, который соединяет вирус с клеткой. Когда он обрывается, вирусная частица отправляется в свободное плавание - заражать новые клетки.

Вирусы используют для своих целей очень многие клеточные процессы. Для сборки новых вирусных частиц ВИЧ тоже использует целую клеточную систему, называемую ESCRT (произносится "эскорт"), которая обычно клетке нужна для того, чтобы создавать и сортировать эндосомы - небольшие пузырьки внутри клетки, служащие для переработки ненужных клеточных компонентов и того, что было захвачено снаружи. Вирусная частица - это в некотором роде такая же эндосома, только вышедшая наружу клетки, а не внутрь и содержащая вирусные компоненты.

В сегодняшней статье не было сделано никакого великого открытия относительно этого процесса. То, что ВИЧ взаимодействует с Tsg101, одним из элементов машины ESCRT, было открыто раньше. Само устройство ESCRT тоже было неплохо уже известно к 2003 году благодаря работам на дрожжах. Но статья Веса Сандквиста на самом деле дает гораздо лучше представление о хорошей науке, чем многие из статей из предыдущих выпусков. Великие открытия выпадают на долю не каждого хорошего ученого, во многом тут играет роль случай и везение. На каждого великого открывателя есть десяток не менее достойных ученых, которые просто очень хорошо делают свое дело и их вклад в конечный результат ничуть не меньше, а может даже и больше. Сегодняшняя статья по признанию самого автора является довольно скучной, но при этом она оказалась самой цитируемой статьей в нашей области за весь 2003 год, потому что в ней содержалась масса очень полезной информации.

После того, как стало известно, что ESCRT играет важную роль в образовании ВИЧ частиц, в лаборатории Веса Сандквиста методично сравнили белки из дрожжей (в которых ESCRT изучали ранее) с человеческими белками, нашли аналоги, и проделали массу экспериментов, чтобы выяснить какие именно белки взаимодействуют между собой и какие влияют на жизненный цикл вируса. Результатом этой работы стала такая вот схема, на которой черными линиями показаны ранее известные взаимодействия белков, а красными - новые. Собственно больше ничего интересного про нее сказать и нечего :)

О существовании у ВИЧ белка vif было известно давно, а также было известно что для вируса он очень важен - даже его само название является сокращением от virus infectivity factor (фактор вирусной инфекционности). Но для чего именно он нужен и как он работает до 2002 года никто не знал. Но были подозрения. Известно было, что в некоторых клетках этот белок очень важен для вируса, а в других - вирус может реплицироваться и без него. Если два этих вида клеток "слить", то в получившемся гибриде вирусу vif был тоже нужен, то есть это свойство клеток было доминантным. Все указывало на то, что в некоторых клетках присутствует нечто, что блокирует ВИЧ, а vif позволяет обходить этот блок.

В лаборатории Майка Малима взялись определить природу этого "нечто". Уникальность их подхода заключалась в том, что они нашли две близкородственные клеточные линии, в одной из которых ВИЧ без vif реплицировался без проблем, а в другой - нет. Дальше они использовали вполне классический подход, в котором РНК этих двух клеток "сравнивается" и все одинаковое отбрасывается, так что остается лишь то, в чем эти клетки отличаются. Таким образом они нашли ген APOBEC3G, который полностью объяснял зависимость репликации ВИЧ от присутствия vif.

Последующие работы выяснили молекулярные основы антивирусного действия APOBEC3G и они оказались очень интересными:

В верхней части рисунка показано, что происходит с ВИЧ если у него нет белка vif. Слева показана зараженная клетка, в которой образуется новая вирусная частица. APOBEC3G упаковывается в вирус и путешествует вместе с ним, пока тот не найдет клетку-мишень. При инфекции новой клетки ВИЧ превращает свою РНК в ДНК. Присутствующий при этом APOBEC3G мутирует вирусную ДНК, превращая цитидин (C) в урацил (U). Получившийся вирусный геном содержит очень много мутаций и не жизнеспособен.

Если у ВИЧ есть белок vif (нижняя часть рисунка), то он блокирует действие APOBEC3G и вирус может нормально реплицироваться.

Интересно также и то, что APOBEC3G оказался лишь одним из членов большого семейства антивирусных белков, которые атакуют преимущественно ретровирусы, но также и вирус гепатита B и адено-ассоциированные вирусы. Каждый член этого семейства имеет свою специфичность и атакует определенные вирусы. Это семейство, а также семейство TRIM белков (о них будет отдельный выпуск) и белок tetherin сейчас даже выделяют в отдельную часть иммунной системы - внутренний (intrinsic) иммунитет.

А более отдаленные родственники APOBEC3G тоже интересны: APOBEC1 был найден как первый пример того, что информация закодированная в ДНК может меняться на уровне РНК - он нацеленно мутирует РНК кодирующую аполипопротеин B, так что в разных клетках один и тот же ген производит два разных белка. AID отвечает за мутирование ДНК иммуноглобулинов в B лимфоцитах, что позволяет иммунной системе улучшать специфичность связывания антител с патогенами.

Считается, что Большинство существующих вакцин работают через выработку антител. Начальные попытки вызвать антитела к ВИЧ закончились провалом. При этом уже описанный мною (здесь, здесь и здесь)прогресс в изучении клеточного иммунитета , привел к тому, что огромное количество лабораторий взялись работать над вакцинами, которые бы вызывали клеточный ответ. При этом считалось, что клеточная вакцина по своей природе не может предотвратить инфекцию, но позволит ее контролировать и замедлять развитие СПИДа.

Одной из первых над такими вакцинами стала работать Хэрриет Робинсон. Для вызова клеточного ответа необходимо, чтобы вакцинные компоненты не просто плавали среди клеток, а экспрессировались внутри клеток. Поэтому она начала работать с ДНК вакцинами, в которых вкалывается человеку, попадает в клетки и какое-то время производит вирусные белки. Довольно быстро выяснилось, что такие вакцины не дают хорошего иммунного ответа - просто вырабатывать чужеродный белок недостаточно для активации иммунной системы. Поэтому они перешли к стратегии прайм-буст. Прайм - это затравка для иммунной системы, дающая начальный сигнал. Буст - дополнительный стимул, повторно активирующий иммунный ответ и фокусирующий его на нужной мишени. Иногда буст приходится делать несколько раз.

Хэрриет стала разрабатывать подход, при котором для прайма используется ДНК, а для буста - вариант ослабленного вируса оспы, использовавшегося для уничтожения оспы, несущий в себе некоторые белки ВИЧ. В 2001 году ее группа опубликовала статью, в которой они описывали попытку использования такой вакцины в макаках. Результат получился именно такой, какой и ожидался: вакцина не защищала их от инфекции, но снижала количество вируса в крови и предотвращала развитие СПИДа. Они также одними из первых стали использовать новейшие технологии по анализу клеточного ответа, вызываемого вакциной. Сейчас, конечно, те методы выглядят устаревшими и очень упрощенными, но тогда это был прорыв.

Надо сказать, что Хэрриет удивительно самоотверженно и эмоционально подходит к своей работе. Несмотря на свой возраст, эта "бабулька" ничуть не потеряла ни энергию ни мотивацию. Я однажды наблюдал, как во время (казалось бы) рутинной презентации на конференции, у нее на слезы были в глазах, когда она рассказывала о том, что им что-то не удалось. Сейчас несколько модифицированный вариант испытывавшейся ею десять лет назад вакцины проходит клинические испытания на людях.

В 1992 году группа Кёртиса в Сиэттле заметила что ВИЧ связывается не только с лимфоцитами, но и еще много с чем, в том числе и с клетками плаценты (чего ради они решили посмотреть именно на плаценту, я не знаю). Немного покопавшись, они нашли, что на клетках плаценты вирус связывается с белком, относящихся к классу лектинов - белков, связывающихся с сахарами. Это имело смысл, потому что как собственный белок оболочки вируса, так и поверхностные клеточные белки, которые вирус заимствует выходя из клетки, гликозилированы. Нашли, и на этом успокоились, потому как вирус не заражал клетки плаценты, а просто прилипал к ним.

Я зря.

Семь лет спустя, группа из Нидерландов исследовала взаимодействие двух видов иммунных клеток - Т лимфоцитов и дендритных клеток (дендритная клетка показана на фотке справа - многочисленные ответвления, дендриты, и дали этим клеткам название). Они нашли, что на поверхности DC есть белок, названный ими DC-SIGN, который связывается с белком ICAM-3 на поверхности лимфоцита. Они клонировали ген DC-SIGN и быстрый поиск по базам данных вывел их на статью 1992 года, в которой этот же самый белок был найден в плаценте и связывался с ВИЧ. Это было само по себе интересно, но тот факт, что DC-SIGN был найден ими на клетках иммунной системы, наводил на мысли, что "это ж-ж-ж неспроста". Но опыта работы с вирусами у них не было, а потому Теюнис Гейтинбик (слева) отправился в Нью-Йорк, в лаботаторию Дэна Литтмана, в которой работали с ВИЧ.

Сначала его ждало разочарование. Оказалось, что ВИЧ не может использовать DC-SIGN для заражения клеток, то есть не является вирусным рецептором. Однако в ходе некоторых экспериментов Теюнис заметил, что в присутствии дендритных клеток способность вируса заражать лимфоциты увеличивалась. Довольно элегантные эксперименты выявили следующую картину: вирус связывается с дендритными клетками через DC-SIGN, но не заражает их, а остается в таком связанном состоянии довольно долго - несколько дней и при этом не теряет инфективности. Если в течение этого срока дендритная клетка встречает Т-лимфоцит, то она передает ему хранимый вирус, причем делает это очень эффективно, так что в расчете на вирусную частицу инфективность вируса существенно увеличивается.

Для того, чтобы объяснить важность этого открытия, следует сначала рассказать немного о роли дендритных клеток в иммунном ответе.

Посмотрим на следующую картинку:

Дендритные клетки (показаны розовым слева) находятся на самой границе с внешним миром - либо прямо в эпидермисе, либо непосредственно под эпителием. Своими дендритами они захватывают чужеродные частицы (красные точки), проникнувшие в организм и даже более того - иногда они высовывают дендриты наружу и собирают частицы, находящиеся на поверхности слизистой. В случае появления большого количества чужеродных частиц они могут начать бить тревогу, выделяя цитокины, которые запускают у окружающих клеток антивирусные механизмы, а также привлекают и активируют нейтрофилов, макрофагов и Т клетки (так называемый врожденный иммунитет). Но основная функция дендритных клеток заключается в том, что они "переваривают" собранный мусор и перемещаются в периферийные лимфоузлы (структура в виде боба), в которых они показывают собранное незрелым лимфоцитам (в виде "перевареных" кусочков). Если лимфоцит реагирует на один из таких кусочков, то он активируется и начинает активно делиться, что ведет к адаптивному иммунному ответу. Зрелые лимфоциты выходят их лимфоузла и движутся на периферию, где они и подавляют инфекцию (правая часть картинки).

ВИЧ использует этот механизм для своих собственных целей. Непосредственно в эпидермисе очень мало его клеток-мишеней, CD4 лимфоцитов. Будучи захвачен дендритной клеткой через DC-SIGN он каким-то образом (точно еще не выяснено как) избегает "переваривания" и дожидается момента, когда дендритная клетка отнесет его в лимфоузел и из рук в руки передаст клетке-мишени. При такой передаче вирус оказывается вполтную прижат к CD4 лимфоциту, а потому имеет гораздо больше шансов проникнуть внутрь, чем если бы он сам связался с ней. Более того, лимфоциты на периферии обычно неактивированы, а потому представляют собой плохие мишени для вируса. В лимфоузле у вируса куда выше шансы встретить активированную клетку. Таким образом связывание с DC-SIGN играет очень важную роль в инициации ВИЧ инфекции.

Работая в лабе, я частенько пользовался дендритными клетками (или клеточными линиями экспрессирующими DC-SIGN) и эффект увеличения эффективности инфекции был очень существенным даже в клеточной культуре. Достаточно к лимфоцитам добавить 5-10% дендритных клеток для того чтобы титр вируса вырос в 10-30 раз.

В прошлом выпуске я писал о множественных особенностях белка оболочки ВИЧ, которые позволяют вирусу обходить иммунный ответ. Но является ли ВИЧ абсолютно неуязвимым для иммунного ответа? Сразу после инфекции количество вируса в крови быстро растет, но потом снижается в 10-100 раз по сравнению с пиковым количеством и после этого остается относительно постоянным. Для многих вирусов антитела являются очевидно важным фактором, контролирующим вирус в естественной инфекции или после вакцинации. Но в случае ВИЧ роль антител была под большим сомнением, хотя бы даже потому, что снижение количества вируса происходит гораздо раньше, чем появляются первые нейтрализующие антитела. В 1994 году Рик Кауп с соавторами показали, что снижение количества вируса совпадает по времени с появлением клеточного иммунного ответа, но многие были не убеждены в том, что между этими двумя факторам есть причинно-следственная связь и предполагали иные возможные причины - например, недостаток клеток мишеней для вируса.

В 1999 году Йорн Шмитц проделал элегантный эксперимент, который показал, что клеточный ответ действительно очень важен для контроля над ВИЧ. Он вводил обезьянам антитело, нацеленное на CD8+ клетки, заставляя иммунную систему уничтожать их. Через 30 минут после введения антитела количество CD8 клеток в крови макак падало почти до нуля, количество же остальных клеток иммунной системы не менялось. Если дополнительных инъекций антитела на делали, то количество CD8 клеток возвращалось к норме через 20-30 дней.
Сначала Шмитц удалил CD8 клетки перед тем, как заразить макак SIV. В этих обезьянах количество вируса росло как обычно, но потом не снижалось, а оставалось на пиковом уровне. Соответственно и к стадии СПИДа эти обезьяны приходили быстрее, чем обычно.
Затем антитело против CD8 было введено уже зараженным обезьянам, в которых количество вируса снизилось. Исчезновение CD8 клеток сопровождалось резким увеличением количества вируса в крови, которое возвращалось к норме лишь после того, как эффект анти-CD8 антитела кончался и CD8 клетки вновь появлялись в крови.

Таким образом была показана прямая связь между контролем вирусной инфекции и CD8 клетками.

Книга "Охотники за микробами" заканчивается главой о Пауле Эрлихе, который изобрел сальварсан - специфичное лекарство против сифилиса. Случилось это в начале 20 века, а первые клинические результаты были опубликованы ровно сто лет назад - в 1911 году.

Потрясающе, но Эрлих и команда нашли сальварсан не случайно, а используя подход, который до сих пор является самым распространенным подходом к разработке лекарств в фармацевтических компаниях. Эрлих был заинтересован тем, что некоторые органические красители специфически окрашивали некоторые виды клеток. Он рассудил, что раз существуют специфические красители, то должны быть и специфические яды. Его группа начала с уже существующего соединения мышьяка с органическим красителем и Альфред Бертейм систематически стал синтезировать разные варианты этого соединения. Он создал библиотеку из почти тысячи соединений. А Хата Сахакиро тестировал их эффективность и токсичность в зараженных сифилисом кроликах. Так они нашли Сальварсан 606 - шестое соединение в шестой группе - которое специфично убивало спирохету, но не было токсичным для кроликов. Как выяснилось (намного) позднее, сальварсан становился активным в результате метаболизма этого соединения внутри спирохеты.

Буквально через год им уже лечили тысячи людей. Побочные эффекты были серьезными, лечение иногда не срабатывало, соединение было очень нестабильным на воздухе и с ним было очень трудно работать, но это было несомненно лучшее из доступных в то время лекарств (это обычно были соли ртути) и осталось таковым вплоть до изобретения пенициллина в 40-х годах. Интересно, что благодаря сальварсану число 606 какое-то время прочно ассоциировалось с сифилисом и его старались избегать, например, в телефонных номерах.

Сегодняшний выпуск посвящен открытию, которое одновременно было помещено на обложку двух самых престижных научных журналов - Science и Nature (такое случается нечасто).

У ВИЧ единственный вирусный белок, который виден иммунной системе на поверхности вириона - это белок оболочки. Поэтому первые попытки сделать вакцину были нацелены именно на него. Но введение этого белка людям и подопытным животным не вызывало нужного иммунного ответа - вырабатывшиеся в ответ на него антитела не нейтрализовали вирус и первое большое клиническое испытание показало, что они не предотвращали инфекцию. Почему это так, стало понятно после работ в лаборатории Джо Содроски. Там пытались получить кристаллы белка оболочки, которые позволили бы узнать его структуру. Пытались долго и упорно, но кристаллы не образовывались. Дело в том, что для образования кристалла требуется более-менее стабильная форма белка, которая может повторяться в кристаллической матрице в одинаковой конфигурации. Про белок оболочки ВИЧ было известно, что во-первых, он весь обвешан олигосахарами, которые не имеют стабильной структуры, а во-вторых, имеет вариабельные участки, которые тоже очень нестабильны и не сворачиваются в стандартные альфа-спирали и бета-складки. Отсюда и проблемы с кристаллизацией.

Питер Квонг, студент в лаборатории Джозефа Содроски, наделал целую кучу вариантов белка оболочки ВИЧ, из которых он (во многом наугад) вырезал разные вариабельные куски и места крепления олигосахаров и после этого пытался получить кристаллы этих измененных белков. Конечно, такие изменения в последовательности белка могли изменить и его структуру, поэтому все варианты проверялись на функциональность - способность связываться с рецептором, с которым обычно связывается ВИЧ, и на распознование ВИЧ-специфичными антителами. Если структура белка менялась очень сильно, то он переставал связываться с рецептором и/или распозноваться антителами. Такие варианты сразу отбрасывались. И в итоге Питеру удалось получить кристаллы, да не просто белка оболочки, а в комплексе с рецептором и с антителом.

Полученная структура многое объяснила в свойствах белка оболочки. Было уже известно, что он является тримером, но в структуре стало видно, что все неизменные его части спрятаны глубоко в середине комплекса. Когда мономерный белок использовался в качестве вакцины, антитела, выработанные к этим неизменным частям, оказывались бесполезны, потому что в тримере на поверхности вируса эти части были спрятаны. Снаружи оставались лишь изменчивые петли, вырабатывать антитела к которым было бесполезно, потому что они не были важны для функции белка и вирус мог легко их изменять. Более того, множественные олигосахара оказались стратегически расположены на поверхности белка так, что предотвращали доступ к нему антител. Но как же связывание с рецептором? Ведь этот район функционально очень важен для вируса и должен располагаться на поверхности. На структуре было видно, что этот район построен в виде глубокой впадины в поверхности белка, которая часто меняет форму и лишь иногда приоткрывается для связывания с рецептором. После начального слабого связывания с рецептором, белок меняет форму на ту, которая позволяет более прочное связывание (так называемый induced fit). И уже эта форма способна распознать дополнительный ко-рецептор, который и используется вирусом для попадания в клетку. Постоянно меняющаяся конформация белка тоже служит защитой от антител, которые довольно специфчны в распознавании антигенов.

Так что эта структура, хотя она и не была полной структурой белка оболочки, многое объясняла в свойствах вируса и в том, почему первые попытки разработать вакцину были неудачными. И, конечно, давала надежду на то, что это знание позволит разработать эффективную вакцину. Как это водится, задача оказалась сложнее, чем ожидалось и реальную пользу в разработке вакцины эта структура начинает приносить лишь сейчас, тринадцать лет спустя. Питер Квонг вырос из студента в профессора и сейчас делает удивительные по красоте и смелости работы, в которых он манипулирует и перестраивает белок оболочки ВИЧ так, как ему угодно. Это позволило, например, ему с товарищами в прошлом году создать "приманку" на которую они выловили из некоторых ВИЧ пациентов нейтрализующие антитела очень широкого спектра действия.

А вот структуру полного немодифицированного белка оболочки с тех пор так получить и не удалось.

С появлением высоко-активной терапии (ВААРТ) стало возможным полностью подавлять вирусную репликацию в пациентах. Часть ученых предполагала, что если продержать пациента на терапии несколько лет, то можно будет полностью вылечить человека от ВИЧ, потому что вирус (или иммунная система) убъет все зараженные клетки, а терапия предотвратит появление новых. Но другие считали, что уничтожить вирус будет трудно, потому что было известно, что вирус заражал долгоживущие CD4 клетки иммунологической памяти. Разрешить этот спор могли лишь эксперименты.

Следующий текст был написан Дианой Финзи, которая в 1997 году была студенткой в лаборатории Роберта Силикано, и которая внесла большой вклад в открытие того, что вирус продолжает существовать в пациентах на ВААРТ (прим: я несколько сократил текст. ЕВ. оригинал здесь).

"Я хорошо помню этот день. Я знала, что проводить тест на присутствие вируса в крови было преждевременно, потому что отрицательный результат ничего бы не сказал нам. Однако положительный был бы неоспорим. Мне не терпелось и я решила провести анализ.

В то время я была студенткой в лаборатории Роберта Силикано в Университете Джона Хопкинса. Ранее мы разработали две методики для детекции вируса в крови пациентов. Обе методики показывали присутствие вируса в долгоживущих CD4 клетках. Методика культивации вируса требовала двадцать пробирок с кровью зараженных пациентов и примерно столько же крови от здоровых доноров, два дня напряженной работе по выделению клеток и месяц культивации.

Появление "коктейлей лекарств" придало нам оптимизма. Резкое снижение количества вируса в крови давало надежду, что после двух-трех лет терапии вирус исчезнет навсегда, если только он не сможет спрятаться в укромных местах организма. Мы знали, что долгоживующие клетки могут быть таким укромных уголком для вируса.

Доктора, лечившие пациентов, очень хотели узнать, может ли вирус прятаться в долгоживущих клетках и были рады дать нам образцы крови из своих пациентов. Мои коллеги и я мотались в Нью Йорк и в Германию за этими образцами, и возвращались в нашу маленькую лабораторию без окон в самое разное время суток, чтобы тут же начать выделение клеток из драгоценных образцов.

В тот день мы впервые тестировали кровь из пациентов принимающих ВААРТ, но мы ожидали, что результаты появятся лишь дней через десять. Стоя над чашкой с ELISA, я смотрела как голубеет жидкость в контрольных образцах. Мое внимание было привлечено к ячейкам с образцами пациентов, которые тоже начали голубеть. Присутствие вируса в этих ячейках означало бы, что долгоживущие CD4 клетки не были полностью свободны от вируса и что ВААРТ не привела к его уничтожению. Это означало бы, что эти клетки служат резервуаром ВИЧ и это бы давало очень плохой прогноз для ВИЧ-положительных пациентов.

Мой стол был самым ближним к офису Боба, но в тот день у него был посетитель и сначала я не хотела прерывать их беседу. Не веря своим глазам я смотрела на то, как карманы с образцами пациентов стали отчетливо голубыми, чувствуя одновременно грусть и важность этого результата. Может это ошибка? Загрязнение образцов? Повторить эксперимент? Или сразу сказать Бобу?

Я больше не могла ждать. Я прервала его встречу и попросила его посмотреть на результаты. Образцы были однозначно положительными и мы с Бобом стояли над ними повторяя раз за разом: "Неужели правда?" "Если это правда, то это очень плохо." "Но все-таки хорошо, что мы это выяснили."

Следующие несколько недель были полны тревогой и работой - мы повторяли эксперименты. Медленно, но верно приходили результаты. Мы нашли вирус в большинстве пациентов, и количество вируса, хотя и не большое, не уменьшалось с увеличением времени на терапии. Наши данные показывали, что пациенты на ВААРТ не были вылечены от ВИЧ и что им придется принимать терапию очень долго, возможно всю жизнь.

За последующие годы наши результаты были неоднократно подтверждены и у пациентов, которые бросали терапию, вирус в крови появлялся опять. Хотя возможно, что существуют и другие резервуары вируса, долгоживующие CD4 клетки являются наиболее изученным из них, и для излечения потребуется найти способ очистить их от вируса. Сейчас, 15 лет спустя, поиск способов уничтожения латентно-инфицированных клеток все еще продолжается."

Я не был на конференции IAS в Ванкувере в 1996 году, но говорят, что представленные на ней результаты высокоактивной терапии, основанной на приеме трех разных антивирусных препаратов, народ встретил стоя овацией (я такого никогда на научной конференции не видел). Результаты показывали полное подавление вируса, восстановление количества CD4 клеток, резкое снижение оппортунистических инфекций и смертей даже среди пациентов на последней стадии СПИДа.

Для нашей иcторической серии, однако, мы выбрали статью из совершенно иной области, почти не относящуюся к лечению или предотвращению ВИЧ, - генной терапии. Генная терапия, как об этом можно догадаться из самого названия, основана на том, что в клетки пациента вводят какой-то ген, который помогает ему справиться с болезнью. Например, мышечная дистрофия вызвана дефектом в гене дистрофин. Если в мышцы встроить нормальную копию этого гена, то они начинают расти нормально. Однако если просто синтезировать ген в виде молекулы ДНК и вколоть его в мышечную ткань, то эффективность его встраивания в мышечные клетки будет очень низкой. Поэтому для доставки генов используют вектора - вирусные частицы, которым вместо их собственного генетического материала подсовывают нужный ген.

Одна из проблем генной терапии заключается в том, что большая часть клеток в нашем организме довольно редко делятся, а это значит, что их генетический материал спрятан за ядерной оболочкой и недоступен для большинства векторов. Дидье Троно в 1996 году работал с ВИЧ и знал, что ВИЧ и родственные ему лентивирусы могут заражать неделящиеся клетки. Поэтому он решил попробовать использовать их в качестве векторов. Его лаборатория показала, что это отлично работает не только в клеточных культурах, но и в крысах, где им удалось ввести ген в нейроны головного мозга.

Сейчас лентивирусные вектора - одни из самых многообещающих для генной терапии. И даже уже были успехи в клинике - два года назад двух пациентов со смертельной болезнью мозга вылечили, взяв у них стволовые клетки крови, введя в них лентивирусным вектором ген ALD и пересадив их обратно пациентам. Сейчас проходит целый ряд клинических испытаний с использованием лентивирусных векторов.

Однако эта работа повлияла не только на генную терапию. В самых разных областях биологии рутинные эксперименты часто основаны на введении нужного гена в клетки. Лентивирусные вектора оказались чрезвычайно удобными для этих целей - в них очень просто встраивать нужный ген, их легко и быстро можно наработать в больших количествах, и после небольшой модификации они могут заражать самые разные виды клеток. Поэтому сейчас их можно найти в тысячах лабораторий по всему миру.

Если вы пропустили выпуск за 1993 год, то советую сначала прочитать его, потому что сегодня будет окончание той истории.

Итак, в 1994 году стало понятно, что ВИЧ инфекция, хотя и длится бессимптомно многие годы, не является классической латентной инфекцией, при которой вирус прячется где-то в организме выжидая ослабления иммунной системы для того, чтобы перейти в активное состояние. Панталео и Фаучи обнаружили, что в бессимптомной стадии вирус продолжает размножаться в лимфатических тканях и ведет к их воспалению и патологии. Марковиц и Хо, герои сегодняшнего выпуска, сделали количественную оценку этой репликации вируса.

Они рассуждали так: Мы наблюдаем более-менее постоянное и довольно большое количество вируса в крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Теория классической латентности предполагала, что эти вирусы были накоплены на ранней стадии инфекции, а иммунная система по какой-то причине не способна их вычистить. Но данные Панталео говорят, что вирус продолжает реплицироваться, так что возможно, что иммунная система вирусы вычищает, но их количество в крови регулярно пополняется новыми. Как узнать, с какой скоростью оно пополняется? Воспользуемся аналогией с бассейном, в который наливается вода и есть сток, но уровень воды остается постоянным. Очевидно, что в такой ситуации скорость наполнения бассейна равна скорости его опустошения. Посадив пациента на антиретровирусные лекарства мы можем полностью перекрыть наполняющий кран и тогда сможем измерить скорость стока, которая же будет равна и скорости наполнения.

Они измерили снижение количество вируса и инфицированных клеток в крови пациентов, только что начавших принимать терапию. И обнаружили удивительную вещь - период полураспада вируса в крови был всего несколько часов! А инфицированных клеток - около полутора дней! Это означало, что вирус в бессимптомной стадии не просто продолжает размножаться, как это открыли Панталео и Фаучи, но он продолжает размножаться очень и очень быстро, ежедневно инфицируя десятки тысяч клеток и производя сотни тысяч новых вирусных частиц.(pdf статьи)

До этого было известно всего два варианта развития вирусной инфекции: Либо вирус побеждал иммунную систему и человек умирал, либо иммунная система побеждала вирус. Во втором случае вирус мог быть полностью вычищен, а мог быть загнан в латентную форму, в которой он не мог принести большого вреда. ВИЧ инфекция оказалась третьим вариантом: При ней вирус и иммунная система долгое время находятся в патовой ситуации, при которой ни одна из сторон не может победить. И важно здесь даже не само патовое состояние, а то, что вирус оказался на это способен. Принцип адаптивной иммунной системы (соматические мутации с последующим селективным отбором и размножением реагирующих с патогеном клеток) считался непреодолимым для вирусов. Если вирусы и побеждали в инфекциях, то лишь захватив иммунную систему врасплох или используя какие-то баги в ее организации. ВИЧ же показал, что он может играть (и не проигрывать) на территории противника, мутируя и адаптируясь быстрее, чем иммунная система. И делать это настолько долго, насколько требуется для того, чтобы в конце концов победить ее.

Обычно считается, что вирусы находятся на узком пике фитнеса и мутации неминуемо ведут к серьезным дефектам в их способности размножаться. Об этом Марковиц и Хо не писали в своей статье, но их данные указывали на то, что ландшафт фитнеса ВИЧ является не остроконечным пиком, а скорее "столовой горой", так что он способен мутировать почти не меняя своей способности реплицироваться. Таким образом они подтверждали во многом гипотетическую до этого теорию "квазивидов" - то есть естественного отбора не индивидуальных последовательностей, а близкородственных популяций.

Большая часть вирусных инфекций длятся недолго, и после этого человек (если он не умер, а с инфекцией справился) остается иммунным к последующим инфекциям. Такие "природные эксперименты" помогают в разработке вакцин, предоставляя пример того, что требуется достичь в процессе вакцинации. Однако с ВИЧ это не работает - не известно ни одного случая, когда иммунная система человека полностью справилась бы с вирусом и человек бы приобрел иммунитет к ВИЧ. Но кое-что из наблюдений за естественными инфекциями узнать можно. В частности, в 1994 году было известно, что количество вируса вскоре после инфекции падает. Одна из теорий о том, почему это случается, предполагала, что иммунная система частично подавляет вирус. Если это так, то теоретически можно попробовать разобраться в том, как она это делает и не можем ли мы ее улучшить. Оппоненты этой теории указывали на то, что количество вируса снижается задолго до того, как начинают вырабатываться антитела против него, а значит причина снижения количества вируса заключается скорее всего в том, что вирус уничтожает большую часть клеток-мишеней и ему просто не в чем больше реплицироваться.

Рик Кауп с соавторами использовали очень сложный и трудоемкий в то время метод для того, чтобы проследить возникновение клеточного иммунного ответа при ВИЧ инфекции. И обнаружили, что его активация хорошо совпадает по времени со снижением количества вируса, таким образом подтвердив теорию о том, что иммунная система способна контролировать (до некоторой степени) репликацию ВИЧ.

Одним из последствий этого открытия стала идея о клеточной вакцине, которая не предотвращает ВИЧ инфекцию и не ведет к полному вычищению вируса, но стимулирует клеточный ответ таким образом, что он намного более эффективно подавляет вирус. То есть человек остается инфицированным на всю жизнь, но не болеет СПИДом и не передает вирус другим людям. О том, чем закончилась эта идея, будет написано выпусков через 10. А сейчас вернемся к Каупу и его комментарию, который он закончил так: "Когда мы опубликовали эту статью, мы думали, что мы разобрались в количественном измерении клеточного иммунитета, и что не пройдет и нескольких лет, как мы откроем все основные секреты ВИЧ-специфичного клеточного иммунитета. Джеф Сафрит, Брюс Уокер и я даже несколько расстроились по поводу того, что нам придется заниматься чем-то иным, поскольку в области ВИЧ изучать уже будет нечего. Как мы были не правы."

pdf статьи
Оригинал комментария Рика Каупа

В сегодняшнем выпуске - коротенькая статья (pdf), которая в комбинации с несколькими другими работами в 1993-95 годах, привела в итоге к одному из самых важных открытий о ВИЧ инфекции. Открытие это не только было важно для понимания патологии ВИЧ и развития СПИДа, но и послужило основой для разработки по настоящему эффективной антиретровирусной терапии. Более того - оно существенно изменило наши общие представления о вирусах и вирусных инфекциях. Но о том, что это было за открытие, я вам пока не скажу :) - придется подождать пару выпусков. А сегодня будет лишь первый шаг к нему.

ВИЧ относится к семейству лентивирусов. Lenti - на латыни означает "медленный". Известные еще до ВИЧ вирусы, отнесенные к этому семейству, были так названы, потому что между инфекцией и болезнью всегда проходило довольно много времени - это были "медленные" вирусы. ВИЧ не только генетически-родственен этим вирусам, но и совпадает по фенотипу - между инфекцией и наступлением иммунодефицита обычно проходит несколько лет. В 1993 году о том, что вирус находится в латентной стадии говорило и то, что количества вируса в крови были довольно небольшими и выделять вирус из здоровых пациентов было сложно (как оказалось впоследствии, это было в первую очередь связано с несовершенными методиками, но тогда об этом никто не знал). О механизмах хронических инфекций тогда было известно не очень много и обычно считалось, что вирус в этой латентной стадии почти не активен, не размножается и "прячется" где-то в организме с тем, чтобы выйти в удобный момент, как это делает, например, вирус герпеса. В отношении ВИЧ эта модель давала сбои. Например, устойчивость к антивирусным лекарствам - каким образом неактивный и нереплицирующийся вирус умудряется эволюционировать и адаптироваться к ним?

Подозревая, что стандартные модели латентности с ВИЧ могут не работать, Джепи Панталео и Тони Фаучи решили посмотреть на иммунную систему в общем здоровых ВИЧ-инфицированных пациентов. В биопсиях из лимфоузлов, а также и в лимфоидных тканях вроде тимуса они нашли куда большие количества вируса, чем в крови. И в них также наблюдались признаки воспаления и патологии. Таким образом, заключили авторы, "состояние классической микробиологической латентности не существует в ходе ВИЧ инфекции... ВИЧ активен и болезнь прогрессирует даже когда отсутствуют явно выраженные вирусные измерения в крови и наблюдается клиническая латентность."

Комментарий Фаучи и Пантелео

"Я отчетливо помню нашего бывшего директора, Рональда Ханта, шагающим в 1982 году по коридорам Гарвардского Приматологического Центра размахивая статьей Готтлиба в NEJM и повторяющим: "Это похоже на то, чем болеют наши обезьяны! Это похоже на то, чем болеют наши обезьяны!" Действительно, макаки в Гарвардском и других приматологических центрах болели каким-то синдромом приобретенного иммунодефицита. Я тогда работал исключительно с гамма герперсвирусами, но решил уделить часть своего времени поиску причин этой обезьянней болезни. Я и не подозревал, что это решение изменит мою профессиональную деятельность на несколько десятилетий."

Так начинается комментарий Рона Дерозиер на его статью 1992 года (pdf). Как выяснилось двумя годами позже, большая часть случаев иммунодефицита в макаках вызывалась вирусом, который принадлежал к иному семейству вирусов, чем ВИЧ. Но в небольшой части макак был найден вирус, являвшийся очень близким родственником ВИЧ. Его назвали ВИО. Группа Рона выделила клон этого вируса, что позволило им детально исследовать его свойства, манипулируя его генами - выборочно выключая их и наблюдая, как это сказывается на способности вируса вызывать болезнь. Выяснилось, что если выключить ген nef, то вирус остается жизнеспособным, но перестает вызывать СПИД. Аттенуированные, ослабленные, вирусы являются классическим подходом к созданию очень эффективных вакцин (например, вакцины от полиомиелита или кори), поэтому было вполне логично проверить, не будет ли этот подход работать и в случае с ВИО. И он действительно сработал - инфицированные мутантным вирусом обезьяны не заражались диким вирусом!

Однако, несмотря на успех, эта вакцина так и не была не то что введена в пользование, но и даже не была протестирована в людях (хотя были энтузиасты, предлагавшие себя в качестве подопытных кроликов). Дело в том, что в случае предыдущих аттенуированных вакцин, вакцинированный человек переболевает болезнью в мягкой форме и потом полностью избавляется от вируса. В случае же с ослабленным ВИО, обезьяны получали инфекцию на всю жизнь. Учитывая высокую вариабельность ВИЧ, шансы на то, что вирус скомпенсирует ослабляющую мутацию и вызовет болезнь были восприняты как слишком высокие. Опасения эти особенно возрасли, когда у вакцинированных таким образом детенышей макак действительно развился СПИД. На сегодняшний день практически никто всерьез не рассматривает возможность использования аттенуированного ВИЧ в качестве вакцины. Ценность этой модели лежит скорее в изучении механизмов, обеспечивающих защиту в надежде на то, что если мы поймем что именно защищает этих макак, то сможем воспроизвести этот механизм и в людях.

Деннис Бёртон в 1991 году создавал методы для выделения ВИЧ-специфичных антител из пациентов. Тогда в моде были фаговые дисплеи - в бактериофаг встраивалась библиотека генов, которую потом можно было наращивать и путем селекции способствовать росту тех фагов, которые несут гены, кодирующие белки с нужной вам функцией. Бёртон искал антитела, которые могли бы связываться с вирусом и нейтрализовать его. Для этого он выделил из ВИЧ-инфицированного пациента библиотеку РНК, кодирующих антитела, скопировал РНК в ДНК и встроил эти гены в фаг таким образом, чтобы антитела появлялись на поверхности фага. После этого можно было проводить селекцию - на подложку был прикреплен белок оболочки вируса. Фагам давали возможность связаться с белком оболочки, несвязавшихся смывали, связавшихся подращивали и повторяли процедуру. Таким образом были найдены 15 антител, которые связывались с ВИЧ очень хорошо. Надежда была на то, что эти антитела можно будет либо напрямую вводить пациентам для контроля вируса, либо разобраться с каким эпитопом (частью вируса) они связываются и использовать его в качестве вакцины. Ни то ни другое, однако, не сработало, потому что выяснилось, что вирус легко может мутировать с тем, чтобы уходить от антител, а вакцина с использованием найденных эпитопов вызывала лишь связывающиеся антитела, которые не обладали нейтрализующим действием.

Интересно, как складываются некоторые карьеры. Почти ровно 20 лет спустя после этих экспериментов Бёртон и коллеги разработали новый способ выделения антител - он намного быстрее, эффективнее и позволяет находить антитела, которые не просто связываются с вирусом, но и нейтрализуют самые разные его варианты. Найденные таким образом нейтрализующие антитела в сотни раз более эффективны, чем антитела найденные в 90-х годах и обладают широким спектром действия.

pdf статьи
Комментарий Бёртона и коллег

В 1991 же году была сделана очень важная работа о взаимодействии ВИЧ и клеточного иммунитета. Вывод ее, с сегодняшних позиций, был тривиален: мутации вируса позволяют ему избежать клеточный иммунный ответ.

Но в 1991 году это была революционная идея. Случаи мутаций в вирусах для избегания гуморального ответа (антител) были хорошо известны, но не был описан ни один случай того, чтобы вирус избегал клеточный иммунитет. Как пишет в своем комментарии Эндрю МкМайкл, статья была многими принята в штыки, отчасти потому, что они не предоставили доказательств активного естественного отбора, действующего на вирус. Некоторые считали, что МкМайкл и коллеги описали реальный, но достаточно редкий даже для ВИЧ случай. Сейчас мы знаем, что ВИЧ действительно активно эволюционирует для избежания клеточного иммунного ответа и никто уже в этом не сомневается. А Эндрю МкМайкла за научные достижения королева Англии в 2008 году посвятила в рыцари.

pdf статьи
Комментарий Эндрю МкМайкла

P.S: Конференция, отпуск... выпуск задержался на неделю. Надеюсь в ближайшее время нагнать.

Интересная новость для энтузиастов арктических экспедиций и просто для читавших книжку Дэна Симмонса "Террор" об экспедиции Джона Франклина в поисках северозападного прохода в 1848 году. Все участники экспедиции погибли, отправившись в поисках пищи в 200-километровое путешествие по льду.
Согласно новому анализу, скелет, найденный исследовательской группой через 25 лет после пропажи экспедиции, принадлежал не Генри Ле Весконту, а доктору экспедиции - Генри Гудсеру. Анализ также показал, что умер доктор скорее всего не от цинги, а анализ отпечатков зубов на кости определил их хозяина как арктическую лису (до этого предполагалось, что это следы каннибализма). Остается непонятным, почему люди на корабле стали умирать в большом количестве и что вынудило Фрэнсиса Крозье (Франклин умер и командование перешло к нему) бросить корабли, в которых было достаточно провианта, и отправиться всей командой в поход. Одна из гипотез - отравление свинцом, содержащимся в консервах или в фильтровальном аппарате. Но пока эту гипотезу проверить не удалось, потому что в 19 веке количество свинца было повышенным у всех жителей Британии.

Картинка из журнала Science:
Слева фотография Генри Гудсер, справа - наложенное лицо, реконструированное по черепу.

Я начал заниматься ретровирусами в 1996 году и к тому времени уже было хорошо известно, что ВИЧ отличается от известных ранее ретровирусов тем, что может заражать неделящиеся клетки. Считалось, что в неделящуюся клетку любой ретровирус попасть может, и даже распаковаться и синтезировать ДНК, но вот в способности интегрироваться в ДНК хозяина ВИЧ отличался. MLV, вирус лейкемии мышей, на этой стадии ждал пока клетка начнет делиться, потому что в процессе деления клетка разбирает свою ядерную оболочку и ее ДНК оказывается доступной для вируса. ВИЧ же не дожидался деления, а мог пройти сквозь поры ядерной оболочки даже в неделящейся клетке, скорее всего потому что у него был сигнал, который клетка использует для доставки белков в ядро.

Моим первым проектом была попытка создать MLV, который бы как и ВИЧ мог заражать неделящиеся клетки. Я угробил на этот проект полтора года своей жизни, но так ничего и не добился. Как выяснилось несколько позднее, в описанной выше ситуации все было намного-намного сложнее. Во-первых, элементы ВИЧ, которые якобы позволяли ему попасть в ядро в неделящихся клетках оказались не имеющими к этому процессу никакого отношения, а важными оказались совсем иные части. Во-вторых, оказалось, что между ВИЧ и MLV существуют важные отличия (например то, ВИЧ в принципе меньше размером и может сквозь ядерную пору пролезть, а MLV для этого слишком велик), которые проявляются не всегда, а лишь в некоторых видах клеток и они запутывали мои эксперименты. Ну и наконец, оказалось, что понятие "неделящаяся клетка" является очень неопределенным и что клетки могут быть "неделящимися", но при этом радикально отличаться одна от другой в целом ряду разных свойств и что модели "неделящихся клеток", которые мы использовали в лаборатории, практически не воспроизводят эти свойства. В общем, утешает меня то, что не я один был совершенно запутан всеми этими заморочками и то, что до сих пор еще в этом до конца не разобрались, а также то, что опыт работы с этим проектом мне пригодился спустя несколько лет на интервью.

Начался же этот бардак примерно в конце 80-х, начале 90-х годов, и статья Джерри Зака (pdf), которую мы и представляем на этой неделе, была одной из наиболее важных в привлечении внимания к этому вопросу. В своей статье Зак и соавторы показали несколько странную вещь - когда они инфицировали ВИЧ неделящиеся неактивированные лимфоциты, то вирус очень плохо их заражал - большинство вирусных ДНК были синтезированы не полностью. Эти частичные ДНК, хотя они и не были встроены в геном клетки-хозяина, могли какое-то время производить вирус, но в конце концов разрушались. Эта статья вызвала массу противоречиий, потому что повторяя эти эксперименты одни группы получали схожие результаты, а другие либо не наблюдали инфекции вообще, либо видели, что вирус инфицирует клетки вполне нормально. Последовал тот самый бардак, о котором я уже писал.

В конце концов все сошлись на том, что лимфоциты существуют не в двух состояниях (1. активированные и делящиеся, когда они борются с инфекцией, и 2. отдыхающие, неделящиеся, пока они еще инфекции не видели, или когда инфекция уже поборена), а в целом градиенте, который упрощенном можно разделить на: 1) неактивированные и неделящиеся, их ВИЧ почти вообще не инфицирует; 2) слега активированные, но неделящиеся, их ВИЧ может инфицировать, но не очень хорошо; и 3) активированные и активно делящиеся, их ВИЧ инфицирует просто отлично. Переход между этими состояниями довольно плавный и регулируется в организме огромным количеством разных иммунных сигналов, вызываемых патогенами и другими клетками иммунной системы.

Интересно, что активация иммунной системы (в ответ на инфекцию) в случае ВИЧ идет лишь на пользу вирусу - она поставляет активированные делящиеся клетки, которые и являются основным топливом для вирусной репликации.

Результаты второго клинического испытания AZT, показавшие что лекарство может не только восстанавливать иммунную систему, но и предотвращать ее разрушение вирусом у ВИЧ-инфицированных, были опубликованы в 1989 году. Хорошие новости, однако, сменились плохими, когда в лаборатории Дугласа Ричмана было открыто, что вирус может приобретать устойчивось к AZT. Устойчивые к AZT формы ВИЧ в скором времени стали серьезной проблемой для лечения СПИДа. Ожидалось, что комбинационная терапия, объединяющая два или более разных лекарств, может предотвратить появление резистентных форм, однако такие коктейли стали доступны лишь несколько лет спустя (и действительно оказались очень успешным методом лечения). Но в 1989 году, все что врачи могли в такой ситуации сделать, это прописать ddI - второе лекарство, утвержденное FDA для лечения СПИДа. Однако оно работало не очень хорошо, потому что устойчивость к AZT часто сопровождалась устойчивостью к ddI.

HIV with Reduced Sensitivity to Zidovudine (AZT) Isolated During Prolonged Therapy
Science, 31 March 1989: Vol. 243 no. 4899 pp. 1731-1734
BA Larder, G Darby and DD Richman
pdf статьи

Комментарий Дугласа Ричмана (вольный и с небольшими сокращениями):

"В этой статье описывается постепенное (в течение нескольких месяцев) развитие устойчивости к AZT среди вирусов, выделенных из пациента на AZT терапии. После этого первого сообщения о появлении устойчивого вируса, тесты на устойчивость стали стандартными при лечении ВИЧ-инфекции и сейчас в коммерциализированном виде доступны во всем развитом мире.

Будучи врачом-инфекционистом, я знал о важности устойчивости к антибиотикам у бактерий, а также тщательно следил за литературой об устойчивости вируса гриппа к амантидину и вируса герпеса к ацикловиру. Вскоре после оглашения результатов первого клинического испытания AZT (в котором я участвовал), я договорился чтобы Брендан Лардер из Burroughs Wellcome (компания, разработавшая AZT) присоединился к моей лаборатории и начал изучать образцы, полученные в ходе этого испытания.

Результаты меня ничуть не удивили. Мы бы не стали искать устойчивые формы, если бы мы не ожидали их найти; однако научное сообщество в целом отнеслось к ним несколько скептически. Когда я написал свой первый грант по изучению устойчивости ВИЧ к лекарствам, он даже не прошел начального отбора; его завернули с комментарием, что обратная транскриптаза не способна мутировать. Реакция на наши исследования прошла через три стадии:
1. Устойчивость невозможна.
2. Результаты верные, но скорее всего не имеющие клинического значения.
3. Всем известно, что устойчивость важна, поэтому эти исследования не так уж интересны.

Даже до публикации, нам с соавторами было ясно, что эти результаты очень важны. Черновую версию статьи мы послали в Burroughs Wellcome. Ответом оказался звонок от раздраженных директоров из UK, заставший меня посреди ночи (из-за 8-часовой разницы во времени), когда я был в отпуске - они не имели права торговать акциями компании до тех пор, пока результаты не были оглашены публично. После этого я и мои соавторы были призваны на конфиденциальное совещание с FDA, NIH, и несколькими "очень уважаемыми консультантами". Мы должны были в деталях рассмотреть все утверждения сделанные в статье, обдумать радиопередачу "Письмо Дорогому Доктору", и обсудить пресс-релизы, которые должны были выйти от нескольких правительственных организаций.

Этот опыт заставил меня понять, что мое образование и склонности к врачебно-исследовательской деятельности, не подготовили меня к новому миру, в котором важны были реакция общественности, регуляторные вопросы и влияние активистов на научные исследования. Этот урок мне пришлось пройти еще несколько раз. Тем не менее, важность и интересность этого важного нового открытия имели долгосрочные последствия и для меня и для науки в целом. Устойчивость ВИЧ к лекарствам стала (и остается) важной частью лечения пациентов. Она является движущей силой для исследования и разработки новых лекарств. Мне она дала годы интереснейших исследований и пробудила мой интерес к вирусной динамике и эволюции."

После того как Пастер своей вакциной спас от бешенства ребенка, которого покусала бешеная собака, к нему пошли люди со всех концов Земли. Из России прибыли 19 крестьян, которых покусал бешеный волк. Действие вакцины (это единственная вакциной, которую ставят после заражения) основывается на том, что у бешенства очень длинный инкубационный период и можно успеть поставить прививку до того как вирус доберется до мозга. Крестьяне, однако, ехали к Пастеру две недели, а потому шансов на то, что их удастся спасти было очень мало. Но Пастер взялся, сократив в два раза время между уколами. За здоровьем "russki mouzhiks" следил весь Париж. Трое умерли, шестнадцать остались живы.
Вот фотография пятнадцати:

Николай Второй, в награду за спасение крестьян, наградил Пастера орденом Анны и прислал 100,000 франков, которые пошли на постройку Института Пастера (его постройка обошлась в миллион).
via Microbe Hunters

Пока доктора испытывали новое лекарство, а специалисты по здравоохранению пытались разобраться в том, как предотвратить распространение вируса среди населения, машина фундаментальной вирусологии начала перемалывать сам вирус. После того как в 1984 году лаборатория Галло показала, как выращивать ВИЧ на культурах трансформированных лимфоцитов, оказалось что работать с этим вирусом относительно просто. Для его изучения не нужны были специальные наглухо изолированные лаборатории, можно было работать в обычных, но соблюдая особые меры предосторожности. О необходимости быть осторожным стало ясно после того как трое ученых, в разных лабораториях, нечаянно заразились, работая с большим количеством вируса.

В 1988 году было сделано довольно много открытий. Какое из них выбрать для нашей серии? Мы остановились на работе Алана Фрэнкеля, почему - скажу в конце. А сначала - интересный отрывок из его комментария:

"Мой предыдущий опыт работы с ДНК-связывающими "цинковыми пальцами" (прим. - особый вид белков) позволил мне синтезировать белок Tat в бактериях и очистить его, но поскольку я не знал, с какой ДНК последовательностью он связывается, мне нужен был какой-то иной способ измерить его активность. Мне попался метод, в котором резиновой лопаткой буквально разрывают плазматическую мембрану клеток, растущих на чашке, что позволяет добавленным после этого белкам получить доступ к содержимому клетки и проявить свою активность. Я добавил Tat к разорванным клеткам, содержащим ген-репортер и, пожалуйста, ген этот активировался. Затем я проделал очевидный контрольный эксперимент, в котором я добавил Tat к неразорванным клеткам и... увидел точно такую же активацию гена-репортера.

После это случайной удачи последовала мучительная неделя безуспешных попыток повторить этот результат. Однако эффект в первом эксперименте был настолько убедителен, что я не мог поверить в то, что его результаты были неверны. Наконец, я понял что во всех последующих экспериментах я упростил протокол и промывал клетки лишь один раз, а не два как раньше, перед тем как добавить Tat. Остатки трипсина, используемого при пересаживании клеток, разрушали добавляемый мною Tat. Я вернулся к исходному протоколу и подтвердил, что мой первый результат был верен."

Фрэнкель открыл интересное свойство одного из дополнительных белков, присутствующих в геноме ВИЧ (о них уже упоминалось в этой серии) - несмотря на свою гидрофильность и положительный заряд, он пересекает клеточную мембрану, а также ядерную мембрану и попадает прямо в ядро. Это настолько удивительно, что довольно долгое время никто не верил в то, что это действительно так (то, что некоторые лаборатории не могли воспроизвести этот результат, делу не помогало). Но постепенно народ проникся и даже стал активно исследовать данный феномен, которому, насколько я знаю, до сих пор не найдено удовлетворительного объяснения. Однако это свойство белка Tat оказалось настолько полезным, что его стали использовать в самых разных областях биологии, прицепляя к Tat белки, которые нужно доставить в клетку, не повреждая ее. Собственно поэтому мы и выбрали эту статью для комментария - научные исследования, насколько бы узок ни был их фокус, почти всегда имеют влияние на отдаленные области знания. Так, здесь исследование небольшого вирусного белка привело к появлению нового инструмента для изучения рака, старения и многих других вопросов.

После того как в 1986 году было обнаружено, что AZT может блокировать репликацию вируса в культуре клеток, почти сразу же было организовано небольшое клиническое испытание на пациентах со СПИДом, которое показало, что AZT в общем нормально ими переносится. Такой быстрый переход от фундаментальной науки к клинике был связан с тем, что большинство пациентов со СПИДом, обнаруженных в начале 1980-х, были уже на последней стадии болезни, а попытки лечить оппортунистические инфекции не помогали. Поэтому быстро было организовано второе испытание, целью которого было определить, имеет ли AZT эффект на клинические проявления СПИДа.

Это испытание было начато в феврале 1986 года и было так называемым "двойным слепым" испытанием - когда ни пациенты ни осматривающие их доктора не знают кто принимает плацебо, а кто лекарство. Эта информация доступна лишь независимой комиссии, которая время от времени собирается, смотрит на предварительные результаты и на их основании решает, имеет ли смысл продолжать испытание или его следует по какой-либо причине остановить. Испытание началось в феврале, а уже в сентябре эта комиссия решила, что его следует прекратить. За прошедшие 6 месяцев в группе, получавшей плацебо, умерло 19 человек (из 137), а в группе, получавшей AZT, умер 1 человек (из 145). Лекарство было настолько эффективно в предотвращении смертности, что продолжать давать контрольной группе плацебо было бы преступлением. Интересно, что в то время не было хороших методов по измерению количества вируса в крови. Все доступные тесты давали лишь ответ "да/нет", в лучшем случае - "много/мало". Поэтому основными наблюдаемыми характеристиками были смертность и частота оппортунистических инфекций (и те и другие снизились в AZT группе).

Параллельно с испытанием эффективности проводилось и исследование побочных эффектов лекарства. В группе с AZT чаще наблюдались тошнота, головокружение, бессонница, головные боли. Более того, в одном из четырех наблюдались анемия и низкий уровень гемоглобина, требующий переливания крови. В одном из шести резко снизился уровень лимфоцитов-нейтрофилов. Чем хуже было состояние пациентов до начала испытания, тем серьезней были у них побочные эффекты. Лекарство работало, но было далеко не идеальным.

Тем не менее, это был первый значительный шаг на пути к эффективной терапии. Был важен сам факт того, что против вируса можно разработать лекарство, которое будет эффективно в снятии симптомов СПИДа и снижении смертности. После этого и академия и фармацевтические компании бросились разрабатывать новые лекарства, более эффективные и менее токсичные. Как оказалось чуть позднее, разработка альтернативных лекарств была критически важно для эффективного лечения. Но об этом - через пару выпусков.

Эта работа была описана в статье "The efficacy of azidothymidine (AZT) in the treatment of patients with AIDS and AIDS-related complex. A double-blind, placebo-controlled trial" (N Engl J Med.1987 Jul 23;317(4):185-91) (pdf статьи). Комментарий Маргарет Фишл (на фотографии выше), первого автора статьи, можно прочитать здесь.