shvarz: (Default)
Я так понимаю, что за последние несколько дней народ подтянулся из-за интереса в серии "30 лет ВИЧ", так что расскажу тут небольшую интересную историю, не вошедшую в тот цикл.

Вскоре после открытия ВИЧ, в 1985 году, были открыты и вирусы иммунодефициты обезьян, что позволило ставить эксперименты на обезьянах (ВИЧ их не заражает), в том числе и тестировать подходы к вакцинации. Одним из первых был протестирован классический подход введения убитого вируса - вирус выращивался в клетках, потом обрабатывался глутаральдегидом и использовался для иммунизации. Вакцина работала прекрасно - защищала обезьян даже при введении большой дозы ВИО внутривенно. Похожие результаты были получены сразу в нескольких лабораториях и в конце 80-х было ощущение, что создание вакцины от ВИЧ - это лишь дело техники.

Однако в 1990 году Джеймс Стотт и товарищи повторяли этот эксперимент и решили в качестве негативного контроля ввести обезьянам гомогенизат незараженных клеток. К их большому удивлению, негативный контроль защищал макак от ВИЧ не хуже, чем инактивированный вирус! Конференция, на которой Стотт представил эти данные, была одной из самых удручающих конференций в истории ВИЧ. Все были просто ошеломлены и растеряны.

Разобрались в вопросе довольно быстро. Оказалось вот что: И ВИО и ВИЧ при выходе их клетки захватывают с собой кусок ее мембраны, вместе с присутствующими на ней белками. Если вы посмотрите на модель ВИЧ от Visual Science, то увидите на поверхности вируса серые белки - это захваченные вирусом клеточные белки. На модели показаны лишь два их вида, на самом деле их может быть больше. Заметьте, что этих белков на поверхности ВИЧ даже больше, чем молекул вирусного белка оболочки (оранжевый).



Поскольку подходящих обезьянних клеточных линий тогда не было, ВИО выращивали в человеческих клетках. Полученный таким образом ВИО имел на своей поверхности эти человеческие белки. Когда его вводили обезьянам, то против них вырабатывался мощный иммунный ответ, который и отвечал за наблюдаемую защиту от вируса. К 1995 году было показано, что подобную защиту можно вызвать иммунизацией обезьян одним конкретным человеческим белком - HLA-DR.
shvarz: (Default)
1 декабря - Всемирный День СПИДа.

Хотя День СПИДа отмечается каждый год, сегодняшний день - особенный, потому что в этом году исполнилось 30 лет с тех пор, как СПИД был открыт. По этому поводу я за последние 30 недель прошелся по некоторым из наиболее интересных и важных научных публикаций и попросил их авторов бросить взгляд назад и рассказать о своем открытии. Оригиналы всех этих статей можно прочитать вот здесь. А в своем журнале я вкратце пересказывал содержание статьи и пытался объяснить, чем она была важна. Все эти мои записи можно найти по тэгу 30 лет ВИЧ.

Сегодня серия заканчивается. На вебсайте нашей организации можно прочитать заключительную статью Хозе Эспарза и Бонни Матиесон, что я читающим по-английски рекомендую сделать. А здесь я хочу сделать некий краткий обзор этих 30 лет. Даже в 30 статьях было невозможно охватить всю историю исследований ВИЧ и СПИДа и, конечно, я не собираюсь пытаться сделать это в этом посте. Поэтому я разобью эти 30 лет на четыре стадии.

1981-1984: Начальный период
После того как СПИД был впервые обнаружен, исследования шли относительно медленно, потому что требовалось установить самые базовые факты - кто подвержен этому синдрому, какова его этиология, насколько широко он распространен. Изначально СПИД представлялся интересным курьезом, а не глобальной проблемой. Связь с вирусом была лишь гипотезой, которую как следует подтвердили лишь позже. Этот этап закончился в 1984 году с разработкой относительно эффективных методов выделения и культивации вируса. Эти методы позволили достичь двух ключевых прорывов: С точки зрения здравоохранения, они позволили создать диагностические тесты, с помощью которых можно было тестировать донорскую кровь и изучать распространенность вируса. С точки зрения фундаментальной науки, они позволили вплотную заняться исследованиями свойств ВИЧ.

1985-1995: Золотой век
В какой-то мере человечеству повезло с исследованиями ВИЧ. В 70-х годах была объявлена "Война с раком", под которую выделили изрядное количество денег. На тот момент считалось, что большой процент раков вызывается вирусами, среди которых ретровирусы были на первом плане, поэтому их стали очень активно исследовать. И хотя впоследствии оказалось, что канцерогенных ретровирусов у человека не так уж и много, в процессе исследований была создана критическая масса знаний, методов и специалистов в этой области. Поэтому когда было обнаружено, что СПИД вызывается ретровирусом, научное сообщество имело все возможности для того, чтобы начать активно изучать его. В это время также был впервые оценен масштаб эпидемии и ВИЧ сразу стал одним из приоритетных направлений. В этот период мы узнали потрясающе много о ВИЧ и о том, как он вызывает СПИД. ВИЧ за несколько лет стал одним из самых изученных вирусов человека. Очень быстро были найдены и внедрены в клинику лекарства, останавливающие вирусную репликацию. Но лечение в этот период было делом ненадежным - лекарства давали мощные побочные эффекты, а вирус приобретал к ним устойчивость. Эти проблемы были решены в 1995 году с изобретением высокоактивной антиретровирусной терапии (ВАРТ), которая позволила надежно подавлять вирус и спасать тяжело-больных.

1996-2008: Тщательный поиск
С изобретением ВАРТ можно было перевести дух - средство для спасения жизней было найдено и эстафетная палочка была передана фарм-компаниям, правительствам и международным фондам, чьей задачей стало предоставить эту терапию всем, кто в ней нуждается (но это уже была задача преимущественно не для ученых). Ученые же взялись дотошно копаться и разбираться в свойствах вируса и вызываемой им болезни. А копаться было в чем - и вирус и поражаемая им иммунная система оказались чрезвычайно сложными. Стало понятно, почему не сработали первые попытки создать вакцину и почему ее создание будет скорее всего делом долгим и трудоемким. Стало также известно, что ВАРТ не ведет к излечению, а потом и прояснились механизмы, позволяющие вирусу существовать в пациенте десятилетиями несмотря на лекарства. Мы узнали о эволюционной истории лентивирусов и о встроенных в нас механизмах борьбы с ними. Были созданы модели для исследования СПИДа в макаках. Всех открытий не описать - за этот период были опубликованы десятки тысяч статей. К сожалению, помимо разработки дополнительных лекарств, все это знание не имело практического применения в здравоохранении.

2008-2011: Новейший период
В науке часто кажется, что "в последнее время прогресс ускорился", так что может я и субъективен в выделении этих последних четырех лет в особый период. Но многое говорит о том, что объективно это действительно так. Были разработаны новые технологии, вроде глубокого секвенирования, массового культивирования B клеток, компьютерного моделирования белков, анализа клеток многоцветным FACS-ом. Эти технологии позволяют делать то, о чем мы раньше только мечтали. Впервые создана вакцина с эффектом (хоть и временным и слабым) против ВИЧ. Показано, что антивирусные препараты можно использовать не только чтобы останавливать болезнь, но и для предотвращения инфекции. Вновь заговорили о полном излечении ВИЧ-инфицированных, и в этой области идут работы по трем принципиально разным направлениям. Складывается ощущение, что в ближайшие несколько лет будут сделаны важные открытия, которые будут иметь прямой эффект на здоровье людей.

В заключение хочу сказать спасибо всем, кто подбадривал меня последние 30 недель. Писать регулярно, с дедлайнами, да еще на довольно сложные научные темы, очень трудно и некоторые посты выходили с запозданием. Но в целом я доволен проектом, надеюсь и вам понравилось :)
shvarz: (Default)
Предпоследний выпуск серии и последний - про научную статью. На следующей неделе будет обзорный выпуск.

А сегодня обсуждаем микробициды - вещества, которые убивают микробов при наружнем применении. В отношении ВИЧ у микробицидов тория даже сложнее, чем у вакцин. Как и с вакцинами, попытки создать микробицид начались почти сразу после открытия вируса. В течение следующих 20-25 лет была испробована дюжина разных веществ и все они оказались либо неэффективными, либо (в паре случаев) увеличивающими риск инфекции. Проблема заключалась в специфичности действия микробицидов - уж очень ВИЧ похож на нормальные человеческие клетки для того, чтобы можно было его повредить не нанося вреда клеткам влагалища или кишечника. Однако эта проблема была решена в области лечения - против ВИЧ существует масса препаратов, которые специфично действуют именно на вирус. Решение, казалось бы, было очевидным - следует сделать гель, который содержал бы антиретровирусные препараты.

Как это часто бывает, ученые разделились на два лагеря - сторонников таких гелей и скептиков. Скептики приводили массу причин, по которым такой подход не будет работать. Во-первых, говорили они, антиретровирусные лекарства действуют на вирус внутри заражаемой клетки, а не на свободно плавающую вирусную частицу, поэтому складывать их в гель и размазывать по стенкам влагалища не имеет большого смысла. Во-вторых, если даже эти лекарства и будут впитываться из геля в клетки, то они будут присутствовать там в слишком низких концентрациях, чтобы остановить вирус, но в достаточных концентрациях, чтобы вызвать у вируса устойчивость к этим лекарствам. В-третьих, лекарства слишком дорогие для того, чтобы из них можно было массово производить микробицидный гель. В-четвертых, для эффективной работы женщины должны пользоваться микробицидом перед каждым сексом, что очень ненадежно и скорее всего им быстро надоест это делать. Были еще и в-пятых, и в-шестых и т.д.

Сторонникам микробицидных гелей приходилось либо следовать своей вере в то, что эти проблемы можно преодолеть, либо делать предварительные исследования, чтобы показать, что они не так серьезны, как говорят скептики. Время шло и в конце концов семейная пара ученых Карриша и Салим Абдул Карим, собрали достаточно информации и заручились достаточной поддержкой для того, чтобы провести настоящее испытание. Компания Gilead, разработавшая антивирусный препарат tenofovir, предоставила лицензию, позволяющую бесплатное использования геля, основанного на этом лекарстве, в Африке. Испытание проводилось в ЮАР, и заняло больше 3 лет. Результаты показали, что регулярное использование геля до и после секса снижало вероятность заражения ВИЧ на 54%. Эффективность не очень высокая, но в масштабах эпидемии, этот микробицид может помочь спасти много жизней.
shvarz: (Default)
Разработку вакцины от ВИЧ часто сравнивают с американскими горками. В 2007 году, когда стали известны результаты испытания Step, большинство ученых впали в депрессию и многие считали, что разработать вакцину не удастся никогда. Но уже в 2009 году, многие были в экстазе от того, что испытание RV144 в Таиланде показало эффективность в предотвращении инфекций. Небольшую (60%) и временную (около года), но эффективность.

У испытания этого была очень сложная судьба.

Задумано оно было в начале 90-х, когда ВИЧ очень мощно ударил по Таиланду. В 1993 году среди призывников в армию 4.6% были заражены ВИЧ, а в некоторых провинциях - и все 12%. Американская военщина в лице Военного Института Исследований Уолтера Рида, еще с начала 20 века имела исследовательский плацдарм в Таиланде и сотрудничала с местным Министерством Здравоохранения при разработке вакцин от японского энцефалита и гепатита А. Они решили, что наблюдающаяся эпидемия позволит им протестировать ВИЧ вакцину и начали подготовку к испытанию. Джером Ким вел основную подготовку со стороны армии США. Но пока они готовились, таиландское правительство тоже не сидело без дела - оно начало анти-ВИЧ кампанию, распространяло информацию о вирусе и активно внедряло использование презервативов в борделях. В результате эпидемия была довольно быстро взята под контроль. Это было отлично для Таиланда, но это означало, что в испытание нужно было привлечь намного больше людей, чем ожидалось вначале, а это значит что испытание становилось более дорогим и требовало больше времени.

В качестве вакцины была выбрана комбинация двух методов - сначала волонтеру делали прививку ослабленным вирусом оспы, несущим в себе несколько белков ВИЧ (т.н. прайм) для инициации клеточного иммунитета, а некоторое время спустя стимулировали выработку антител, вводя белок оболочки ВИЧ (т.н. буст). Вначале предполагалось, что в небольшом испытании будут сравнены три подхода - в каждом из них будет один и тот же прайм, но вот белок оболочки будет разный, произведенный тремя разными компаниями. Тот белок, который даст наилучший иммунный ответ, и будет использован в большом испытании на эффективность в предотвращении инфекции. Идея хорошая, но и тут исследователей ожидали проблемы: еще до начала первого испытания две компании из трех решили, что они больше не хотят принимать участие в испытании. В результате, сравнивать стало нечего и на большое испытание пришлось идти с единственным оставшимся кандидатом. Проблемы были не только с бустом, но и с праймом - вирус не прошел проверку качества и его пришлось переделывать, что отложило начало испытания на целый год.

Пока разбирались с производственными проблемами, пришли проблемы научные. Испытания похожих вакцин в макаках давали противоречивые результаты. Испытания на небольших группах людей показывали, что вызываемый подобными вакцинами иммунный ответ очень слаб (хотя без знания того, что именно нужно для защиты от ВИЧ, понятия "слаб" и "силен" были очень размытыми). Спонсируемая NIH группа HVTN собиралась тестировать похожую вакцину в Америке, но решила отменить испытание, поскольку ожидала, что вакцина будет неэффективной. И самый мощный удар был нанесен испытанием AIDSVAX B/E, которое тестировало тот самый белок оболочки, который исследователи собирались использовать в качестве буста, и нашло что он не имеет никакого эффекта.

В 2004 году группа из 15 очень уважаемых ученых в области ВИЧ вакцин написала открытое письмо в NIH, которое было опубликовано в журнале Science. В этом письме они указывали на то, что все имеющиеся научные данные говорят о том, что вакцина будет неэффективна и призывали NIH прекратить финансирование испытания. Честно скажу, что я тогда был полностью на стороне этих сомневающихся товарищей (и до сих пор считаю, что в принципе они были правы). Поднялась изрядная буча, и в итоге NIH выбрала наихудший из подходов, решив ублажить и ваших и наших. Финансирование исследования не прекратили, но бюджет изрядно урезали. Под нож попала преимущественно научная составляющая испытания - сбор образцов крови и их иммунологический анализ.

В результате, когда в 2009 году были проанализированы все собранные данные и выяснилось, что вакцина имела некоторый эффект, возможности для анализа того, какой именно из иммунологических ответов играл решающую роль в предотвращении инфекции, оказались очень ограниченными. Тем не менее, анализ имеющихся образцов выдал какие-то корреляции и сейчас планируются испытания, которые будут тестировать гипотезы, сформированные основываясь на полученных данных.

Так что если бы не настойчивость (если не сказать, упертость) Джерома Кима и его начальника командира Нелсона Майкла, область ВИЧ вакцин до сих пор бы пребывала в депрессии, обсуждая провальные результаты Step и не имея никакой зацепки для того, чтобы двигаться дальше.
shvarz: (Default)
В этой серии статей я до сих пор рассказывал лишь о важных открытиях или успехах в исследовании ВИЧ. Сегодня будет рассказ об одной очень важной неудаче.

В 2003 году началось испытание ВИЧ вакцины, названное Step. Идея этой вакцины основывалась на знании того, что Т клетки играют важную роль в контроле ВИЧ инфекции. Ее создатели ожидали, что она не предотвратит инфекции, но позволит иммунной системе более эффективно бороться с вирусом и таким образом оттянет (или вообще предотвратит) наступление СПИДа. Опыты, поставленные на макаках, подтверждали, что такая вакцина может работать.

В качестве метода доставки вакцины был выбран аденовирус. Аденовирусов в мире очень много разных, но все они вызывают легкие простудные заболевания. Выбранный аденовирус (типа 5) был модифицирован таким образом, что заразить он мог только одну клетку, а дальше распространяться не мог. В этой зараженной клетке он синтезировал три белка ВИЧ, так что для Т лимфоцитов клетка выглядела зараженной ВИЧ и против нее срабатывал клеточный иммунитет.

Использование аденовирусов, как метода доставки вакцины, затрудняется тем, что многие люди болеют этими вирусами, а потому имеют антитела против них. Если человеку с антителами ввести аденовирусную вакцину, то вирус будет мгновенно нейтрализован и не сможет доставить белки, против которых требудется вызвать иммунный ответ. Поэтому сначала в испытание Step собирались брать лишь тех, у кого антител к аденовирусу 5 не было вообще или было очень мало. Однако предварительные испытания на людях показали, что антитела этой вакцине не помеха - она вызывает клеточный иммунный ответ даже в людях с антителами (видимо потому что антитела недостаточно эффективны). Поэтому когда испытание началось, то в него брали всех желающих, хотя уровень антител к аденовирусу и отслеживали.

Как наверняка известно читателям моего журнала, золотым стандартом в современной клинической науке считается двойное слепое тестирование - то есть до конца испытания ни исследователи, ни участники испытания не знают о том, кто получил плацебо, а кто - тестируемое средство. В долгоидущих и больших клинических испытаниях существует следующая практика: Выбирается комитет независимых экспертов, который смотрит через определенные интервалы на предварительные данные и решает, стоит ли продолжать испытание. В некоторых случаях такая комиссия может остановить испытание. Во-первых, если становится очевидно, что тестируемое средство бесполезно или даже вредно. Во-вторых, если становится очевидно, что тестируемое средство очень хорошо работает (тогда неэтично продолжать давать контрольной группе плацебо). И, наконец, если по каким-то причинам становится ясно, что испытание не сможет ответить на изначально поставленные вопросы. Для испытания ВИЧ вакцины Step такая комиссия тоже собиралась и в 2007 году, после одного из таких анализов, эта комиссия сказала, что испытание следует прекратить, так как вакцина очевидно бесполезна.

Но это было еще полбеды. Копаясь в уже собранных за время испытания данных, Сюзан Букбайндер и соавторы обнаружили, что какое-то время после вакцинации некоторые подгруппы людей в испытании имели больший шанс заразиться ВИЧ, чем те, кто получил плацебо. Одной из таких групп были необрезанные мужчины, другой - люди с большим количеством антител к аденовирусу. В комбинации два этих фактора увеличивали вероятность инфекции (среди получивших вакцину) в 3 раза. Следует сказать, что такой анализ, сделанный на данных пост-фактум, является в гораздо меньшей степени доказательным (потому что какие-то тенденции можно обнаружить в любом массиве данных), но приняв в учет вероятные биологические механизмы, большинство научного сообщества считают, что увеличенный риск инфекции действительно был. Так это или нет на самом деле, мы теперь уже никогда не узнаем (потому что повторять такой эксперимент никто не будет). К сожалению, такие вещи случаются, и предсказать их заранее практически невозможно.
shvarz: (Default)
Сегодняшняя история интересна тем, насколько она растянулась по времени. Впервые то, что обрезание снижает вероятность заражения ВИЧ, было замечено аж в 1989 году. После этого похожие наблюдения были сделаны в целом ряде исследований, и одним из первых, кто заметил этот эффект был Стивен Мозес, автор сегодняшнего комментария. Но поскольку обрезание - часть культурной традиции, отделить биологический эффект от культурного было очень сложно и скептики (в достаточной мере правомерно) требовали более строгого подтверждения. Так прошло десять лет. От сторонников обрезания требовали рандомизированного испытания (в котором волонтер заранее соглашается, что его назначат либо в группу с обрезанием, либо в контрольную группу). Вообще непонятно было, согласится ли кто на такой странный эксперимент. Поэтому сначала были проведены исследования относительно того, насколько реально провести это исследование. К некоторому удивлению ученых, желающих нашлось немало. Так что в начале 2000-х годов были начаты три подобных испытания - в Кении, в Уганде и в ЮАР.

В клинических испытаниях сейчас принято где-нибудь посередине показывать промежуточные результаты специальной комиссии, состоящей из ученых, экспертов по этике и представителей той популяции, в которой проходит испытание. Если эти промежуточные результаты показывают, что тестируемое средство или однозначно полезно или однозначно бесполезно (или, тем более, вредно), то продолжение такого испытания считается неэтичным и его прерывают. Так случилось со всеми тремя испытаниями обрезания. Промежуточные результаты показали, что обрезание однозначно снижает риск заражения ВИЧ, а поэтому следовало их прекратить, сообщить об этом результате всем участникам и предложить им сделать обрезание. Усредненный результат по трем испытаниям был - снижение вероятности заражения на 56%. Не так уж плохо, что бы ни говорили нам великие умы.

После того, как эффект обрезания был подтвержден, правительства разных стран в Африке, а также международные организации стали активно пропагандировать эту практику. Спрос оказался очень большим и опередил предложение, так что некоторые даже стали разрабатывать поточные методы для проведения этих операций.

Одной из важных проблем в таком методе предотвращения инфекций является понятное объяснение людям (зачастую малообразованным и суеверным), что они не защищены от ВИЧ, а лишь немного снизили вероятность его подхватить. Иначе эффект может быть совершенно противоположным. Один из способов это донести мне очень нравится. Во многих странах Африки все просто фанатеют от футбола. При обрезании мужчинам приводят такую аналогию: "Раньше ты был как ворота без вратаря, в которые очень легко было забить мяч. Сейчас мы тебе в ворота поставили вратаря, но, сам знаешь, даже с вратарем в воротах, от гола никто не застрахован. Так что продолжай использовать всю команду - презервативы, одна партнерша, и т.д."
shvarz: (Default)
Активированный иммунный ответ - дело для организма дорогое и опасное, а значит его нужно тщательно контролировать. Очень большое количество симптомов (воспаление, температура, боль, и т.д), которые мы обычно ассоциируем с болезнями, вызываются не патогеном, а иммунным ответом. Поэтому когда в ответ на инфекцию в организме запускается иммунный ответ, почти одновременно запускаются и механизмы его (иммунного ответа) подавления. Они настроены так, что срабатывают с запозданием, когда болезнь уже почти побеждена и играют роль лишь в возвращении организма к норме.

Что же происходит в хронических инфекциях, которые за неделю-другую не проходят? С одной стороны иммунная система постоянно стимулируется присутствием микроба, с другой - подавляется гомеостатическими механизмами, пытающимися вернуть ее в нормальное, неактивированное состояние. В результате развивается анергия - Т лимфоциты хотя и распознают чужеродные белки, но становятся неспособными выполнять свои нормальные функции или выполняют их плохо. В лаборатории Рафи Ахмеда изучали хроническую инфекцию CMV в мышах и обнаружили, что при этой инфекции лимфоциты начинают синтезировать специальный рецептор PD1, который появляется на их поверхности. И состояние анергии у лимфоцитов вызывается именно сигналами, получаемыми через этот рецептор.

Параллели с ВИЧ инфекцией были очевидны для Брюса Уокера из Гарварда. Узнав о результатах Рафи Ахмеда еще до официальной публикации статьи, он тут же начал схожее исследование на ВИЧ-инфицированных в Южной Африке. Анализ собранных образцов подтвердил гипотезу - и CD4 и CD8 лимфоциты ВИЧ-инфицированных экспрессировали PD1. Чем больше было PD1, тем выше было количество вируса и тем хуже был прогноз болезни. И в первую очередь анергия развивалась в тех клетках, которые распознавали ВИЧ. Особенно интересным и многообещающим для лечения хронических инфекций было то, что если передачу сигналов через PD1 блокировать, то анергия проходит и лимфоциты опять начинают реагировать на чужеродные белки. Сейчас планируют клинические испытания, в которых будут тестироваться ингибиторы PD1, чтобы посмотреть, не приведет ли это к более эффективному иммунному ответу против ВИЧ. Такие испытания проводятся (или планируются) и для других хронических инфекций, например гепатитов B и C.
shvarz: (Default)
Предисловием к сегодняшнему выпуску являются мои посты о статьях 1993 и 1995 годов, в которых было показано, что инфекция ВИЧ на той стадии, пока она не перешла еще в СПИД, не является классической латентной инфекцией. При латентной инфекции (например, герпеса) вирус не реплицируется, я прячется и выжидает ослабления иммунной системы, а ВИЧ все эти годы активно размножается и инфицирует клетки. Попытки посчитать процент зараженных лимфоцитов в крови или в биопсиях лимфоузлов давал довольно низкие цифры (около 1%), что говорило в пользу того, что вирус хотя и не латентен, но не заражает CD4 клетки по всему организму. Основным местом размножения вируса считался кишечный тракт, который густо заселен лимфоцитами. Таким образом, в организме должно было быть достаточно CD4 клеток для борьбы с инфекцией. Это объяснение (как оказалось неверное) объясняло почему до наступления СПИДа у ВИЧ-инфицированных не наблюдается большого количества инфекций и почему болезнь прогрессирует постепенно - вирус постепенно уничтожает CD4 клетки. Так, где-то до середины 2000 годов многие думали о ВИЧ инфекции как о медленно-прогрессирующей болезни, которая лишь в конце ведет к серьезным нарушениям в иммунной системе (СПИДу).

Марио Родерер и Джозеф Маттапаллил взялись подробно исследовать патогенез ВИЧ на ранних стадиях инфекции. Для этого они обратились к инфекции ВИО в макаках, что позволяло им, во-первых, точно знать срок с момента инфекции и, во-вторых, разобрать инфицированный организм на кусочки и тщательно все анализировать. За время своей жизни, CD4 клетки проходят несколько разных стадий. Только что вышедшая из тимуса наивная (это такой научный термин) CD4 клетка претерпевает изменения после того, как встречает патоген. Она превращается в эффекторную CD4 клетку, которая активно участвует в борьбе с инфекцией. Когда инфекция подавлена, то CD4 клетка претерпевает очередное изменение и превращается в CD4 клетку памяти. При повторной инфекции клетка памяти опять превращается в эффекторную клетку, но с несколько иными свойствами. В той или иной степени ВИЧ заражает все эти подвиды CD4 клеток, но эффективность инфекции наибольшая для активированных клеток памяти (об этом я тоже уже писал).

Разобрав зараженных макак на запчасти, Джозеф и Марио обнаружили, что почти 80% всех CD4 клеток памяти были уничтожены ВИО. И это наблюдалось не только в кишечном тракте, но и по всему остальному организму. Они проследили и измерили волну инфекции, проходящую и уничтожающую популяцию этих клеток. Через неделю после инфекции зараженных клеток было еще очень мало. Но уже на десятый день почти все клетки памяти были заражены вирусом, а к 14 дню большая часть зараженных клеток начал умирать. Как оказалось позднее, частично такой драматический результат был вызван тем, что они вводили довольно большую дозу вируса макакам внутривенно. При инфекции через слизистые поверхности динамика была несколько медленней. Тем не менее, этот результат показал, что вирус наносит серьезный урон иммунной системе очень быстро - в первые несколько недель.

Почему же эффект такого нарушения не проявляется сразу же? Почему инфекции начинают одолевать зараженных лишь спустя годы после инфекции? На этот вопрос Родерер и Маттипаллил в своей статье не отвечают, но я тут приведу современные воззрения по этому поводу. Преимущественно уничтожая CD4 клетки памяти вирус нарушает нашу способность более эффективно бороться с повторными инфекциями, а не с новыми. При этом нарушает он лишь часть иммунного ответа и, например, уже существующие плазма-клетки, производящие антитела против прошлых инфекций, так и продолжают это делать. Иммунодефицит, вызываемый ВИЧ, не является прямым последствием потери CD4 клеток, а вызван тем, что в течение многих лет в лимфатических тканях присутствует инфекция и идет воспаление. В процессе этого воспаления лимфатические ткани зарубцовываются подобно шрамам - заполняются нейтральными нефункциональными клетками и, таким образом, теряют свою функцию - создание микросреды, необходимой для созревания и нормальной активации иммунной системы. Этот процесс и ведет в итоге к иммунодефициту.
shvarz: (Default)
ВИЧ, как известно, произошел от ВИО - вируса иммунодефицита обезьян (читать подробности). Но если ВИЧ ввести обезьянам, то ничего не произойдет. Даже если инфекция и случится, то СПИД не разовьется. Почему? Потому что и у них есть антивирусный белок TRIM5alpha. Этот белок ловит вирус на входе в клетку и отправляет его на разрушение. ВИО может существовать в обезьянах, потому что он наловчился убегать от TRIM5alpha. У людей такой белок тоже есть, но у нас он отличается от обезьяннего. Когда ВИО перескочил в человека, то вирусу пришлось приспособиться к нашей версии белка TRIM5alpha и при этом он потерял способность уворачиваться от обезьяннего TRIM5alpha.

Как так получилось, что наша версия TRIM5alpha отличается от обезьянней? Точно мы не знаем, но одна студентка в моей прошлой лаборатории раскопала интересную историю, из которой получается, что примерно 4 миллиона лет назад в Африке бушевал страшный вирус, который косил всех приматов налево и направо, и из людей выжили лишь те мутанты, у которых TRIM5alpha мог с этим вирусом бороться (читать подробности).

До 2004 года о существовании TRIM5alpha догадывались, потому что было известно, что репликацию ВИЧ в клетках обезьян блокирует какой-то антивирусный агент, но именно работа Мэта Стремлау в лаборатории Джо Содроски открыла, что именно это был за белок. Для этого Мэту пришлось воспользоваться классическим методом, в котором в человеческие клетки была заброшена библиотека обезьянних генов. Клетки, получившие ген, кодирующий антивирусный белок, стали устойчивыми к инфекции ВИЧ и это позволило его определить. Впоследствии оказалось, что у TRIM5alpha есть целая семья родственников и все они имеют антивирусные функции. Вместе с уже описанным семейством антивирусных белков APOBEC, семейство TRIM относят к "внутреннему" иммунитету.

Еще белок TRIM5alpha интересен тем, что он вовлечен в уникальный случай параллельной молекулярной эволюции. Параллельная эволюция - это когда одинаковые признаки появляются в эволюции в двух разных видах независимо. Например - крылья птиц и крылья летучих мышей. Так вот, многие ретровирусы зачем-то связываются с белком циклофилином и эволюция нашла способ использовать этот факт дважды: один раз в южноамериканских обезьянах, другой раз в резус-макаках в Африке. В обоих случаях ген циклофилина был скопирован (вернее перенесен ретротранспозоном, но в эти детали я сейчас вдаваться не буду) и встроен в ген TRIM5alpha, да так, что кусок TRIM5alpha, в норме отвечающий за распознавание вируса, был замещен геном циклофилина. Получившийся в итоге химерный белок приобрел свойство блокировать ретровирусы, которым нужен циклофилин.

Вообще, существование APOBEC и TRIM показывает насколько были важны ретровирусы в нашей эволюции - для борьбы с ними мы приобрели в ходе эволюции целые семейства генов, чьей функцией является почти исключительно борьба с этими вирусами.
shvarz: (Default)
Сборка новых вирусных частиц ВИЧ происходит следующим образом:


Вирусный белок Pr55gag полимеризуется в цитоплазме и его комплексы собираются рядом с клеточной мембраной. В эти комплексы включаются дополнительные вирусные белки и вирусная РНК. В мембрану встраивается белок оболочки. Вся эта компания постепенно выпучивается наружу, так что в конце концов остается лишь небольшой мостик, который соединяет вирус с клеткой. Когда он обрывается, вирусная частица отправляется в свободное плавание - заражать новые клетки.

Вирусы используют для своих целей очень многие клеточные процессы. Для сборки новых вирусных частиц ВИЧ тоже использует целую клеточную систему, называемую ESCRT (произносится "эскорт"), которая обычно клетке нужна для того, чтобы создавать и сортировать эндосомы - небольшие пузырьки внутри клетки, служащие для переработки ненужных клеточных компонентов и того, что было захвачено снаружи. Вирусная частица - это в некотором роде такая же эндосома, только вышедшая наружу клетки, а не внутрь и содержащая вирусные компоненты.

В сегодняшней статье не было сделано никакого великого открытия относительно этого процесса. То, что ВИЧ взаимодействует с Tsg101, одним из элементов машины ESCRT, было открыто раньше. Само устройство ESCRT тоже было неплохо уже известно к 2003 году благодаря работам на дрожжах. Но статья Веса Сандквиста на самом деле дает гораздо лучше представление о хорошей науке, чем многие из статей из предыдущих выпусков. Великие открытия выпадают на долю не каждого хорошего ученого, во многом тут играет роль случай и везение. На каждого великого открывателя есть десяток не менее достойных ученых, которые просто очень хорошо делают свое дело и их вклад в конечный результат ничуть не меньше, а может даже и больше. Сегодняшняя статья по признанию самого автора является довольно скучной, но при этом она оказалась самой цитируемой статьей в нашей области за весь 2003 год, потому что в ней содержалась масса очень полезной информации.

После того, как стало известно, что ESCRT играет важную роль в образовании ВИЧ частиц, в лаборатории Веса Сандквиста методично сравнили белки из дрожжей (в которых ESCRT изучали ранее) с человеческими белками, нашли аналоги, и проделали массу экспериментов, чтобы выяснить какие именно белки взаимодействуют между собой и какие влияют на жизненный цикл вируса. Результатом этой работы стала такая вот схема, на которой черными линиями показаны ранее известные взаимодействия белков, а красными - новые. Собственно больше ничего интересного про нее сказать и нечего :)
shvarz: (Default)
О существовании у ВИЧ белка vif было известно давно, а также было известно что для вируса он очень важен - даже его само название является сокращением от virus infectivity factor (фактор вирусной инфекционности). Но для чего именно он нужен и как он работает до 2002 года никто не знал. Но были подозрения. Известно было, что в некоторых клетках этот белок очень важен для вируса, а в других - вирус может реплицироваться и без него. Если два этих вида клеток "слить", то в получившемся гибриде вирусу vif был тоже нужен, то есть это свойство клеток было доминантным. Все указывало на то, что в некоторых клетках присутствует нечто, что блокирует ВИЧ, а vif позволяет обходить этот блок.

В лаборатории Майка Малима взялись определить природу этого "нечто". Уникальность их подхода заключалась в том, что они нашли две близкородственные клеточные линии, в одной из которых ВИЧ без vif реплицировался без проблем, а в другой - нет. Дальше они использовали вполне классический подход, в котором РНК этих двух клеток "сравнивается" и все одинаковое отбрасывается, так что остается лишь то, в чем эти клетки отличаются. Таким образом они нашли ген APOBEC3G, который полностью объяснял зависимость репликации ВИЧ от присутствия vif.

Последующие работы выяснили молекулярные основы антивирусного действия APOBEC3G и они оказались очень интересными:



В верхней части рисунка показано, что происходит с ВИЧ если у него нет белка vif. Слева показана зараженная клетка, в которой образуется новая вирусная частица. APOBEC3G упаковывается в вирус и путешествует вместе с ним, пока тот не найдет клетку-мишень. При инфекции новой клетки ВИЧ превращает свою РНК в ДНК. Присутствующий при этом APOBEC3G мутирует вирусную ДНК, превращая цитидин (C) в урацил (U). Получившийся вирусный геном содержит очень много мутаций и не жизнеспособен.

Если у ВИЧ есть белок vif (нижняя часть рисунка), то он блокирует действие APOBEC3G и вирус может нормально реплицироваться.

Интересно также и то, что APOBEC3G оказался лишь одним из членов большого семейства антивирусных белков, которые атакуют преимущественно ретровирусы, но также и вирус гепатита B и адено-ассоциированные вирусы. Каждый член этого семейства имеет свою специфичность и атакует определенные вирусы. Это семейство, а также семейство TRIM белков (о них будет отдельный выпуск) и белок tetherin сейчас даже выделяют в отдельную часть иммунной системы - внутренний (intrinsic) иммунитет.

А более отдаленные родственники APOBEC3G тоже интересны: APOBEC1 был найден как первый пример того, что информация закодированная в ДНК может меняться на уровне РНК - он нацеленно мутирует РНК кодирующую аполипопротеин B, так что в разных клетках один и тот же ген производит два разных белка. AID отвечает за мутирование ДНК иммуноглобулинов в B лимфоцитах, что позволяет иммунной системе улучшать специфичность связывания антител с патогенами.
shvarz: (Default)
Считается, что Большинство существующих вакцин работают через выработку антител. Начальные попытки вызвать антитела к ВИЧ закончились провалом. При этом уже описанный мною (здесь, здесь и здесь)прогресс в изучении клеточного иммунитета , привел к тому, что огромное количество лабораторий взялись работать над вакцинами, которые бы вызывали клеточный ответ. При этом считалось, что клеточная вакцина по своей природе не может предотвратить инфекцию, но позволит ее контролировать и замедлять развитие СПИДа.

Одной из первых над такими вакцинами стала работать Хэрриет Робинсон. Для вызова клеточного ответа необходимо, чтобы вакцинные компоненты не просто плавали среди клеток, а экспрессировались внутри клеток. Поэтому она начала работать с ДНК вакцинами, в которых вкалывается человеку, попадает в клетки и какое-то время производит вирусные белки. Довольно быстро выяснилось, что такие вакцины не дают хорошего иммунного ответа - просто вырабатывать чужеродный белок недостаточно для активации иммунной системы. Поэтому они перешли к стратегии прайм-буст. Прайм - это затравка для иммунной системы, дающая начальный сигнал. Буст - дополнительный стимул, повторно активирующий иммунный ответ и фокусирующий его на нужной мишени. Иногда буст приходится делать несколько раз.

Хэрриет стала разрабатывать подход, при котором для прайма используется ДНК, а для буста - вариант ослабленного вируса оспы, использовавшегося для уничтожения оспы, несущий в себе некоторые белки ВИЧ. В 2001 году ее группа опубликовала статью, в которой они описывали попытку использования такой вакцины в макаках. Результат получился именно такой, какой и ожидался: вакцина не защищала их от инфекции, но снижала количество вируса в крови и предотвращала развитие СПИДа. Они также одними из первых стали использовать новейшие технологии по анализу клеточного ответа, вызываемого вакциной. Сейчас, конечно, те методы выглядят устаревшими и очень упрощенными, но тогда это был прорыв.

Надо сказать, что Хэрриет удивительно самоотверженно и эмоционально подходит к своей работе. Несмотря на свой возраст, эта "бабулька" ничуть не потеряла ни энергию ни мотивацию. Я однажды наблюдал, как во время (казалось бы) рутинной презентации на конференции, у нее на слезы были в глазах, когда она рассказывала о том, что им что-то не удалось. Сейчас несколько модифицированный вариант испытывавшейся ею десять лет назад вакцины проходит клинические испытания на людях.
shvarz: (Default)
В 1992 году группа Кёртиса в Сиэттле заметила что ВИЧ связывается не только с лимфоцитами, но и еще много с чем, в том числе и с клетками плаценты (чего ради они решили посмотреть именно на плаценту, я не знаю). Немного покопавшись, они нашли, что на клетках плаценты вирус связывается с белком, относящихся к классу лектинов - белков, связывающихся с сахарами. Это имело смысл, потому что как собственный белок оболочки вируса, так и поверхностные клеточные белки, которые вирус заимствует выходя из клетки, гликозилированы. Нашли, и на этом успокоились, потому как вирус не заражал клетки плаценты, а просто прилипал к ним.

Я зря.

Семь лет спустя, группа из Нидерландов исследовала взаимодействие двух видов иммунных клеток - Т лимфоцитов и дендритных клеток (дендритная клетка показана на фотке справа - многочисленные ответвления, дендриты, и дали этим клеткам название). Они нашли, что на поверхности DC есть белок, названный ими DC-SIGN, который связывается с белком ICAM-3 на поверхности лимфоцита. Они клонировали ген DC-SIGN и быстрый поиск по базам данных вывел их на статью 1992 года, в которой этот же самый белок был найден в плаценте и связывался с ВИЧ. Это было само по себе интересно, но тот факт, что DC-SIGN был найден ими на клетках иммунной системы, наводил на мысли, что "это ж-ж-ж неспроста". Но опыта работы с вирусами у них не было, а потому Теюнис Гейтинбик (слева) отправился в Нью-Йорк, в лаботаторию Дэна Литтмана, в которой работали с ВИЧ.

Сначала его ждало разочарование. Оказалось, что ВИЧ не может использовать DC-SIGN для заражения клеток, то есть не является вирусным рецептором. Однако в ходе некоторых экспериментов Теюнис заметил, что в присутствии дендритных клеток способность вируса заражать лимфоциты увеличивалась. Довольно элегантные эксперименты выявили следующую картину: вирус связывается с дендритными клетками через DC-SIGN, но не заражает их, а остается в таком связанном состоянии довольно долго - несколько дней и при этом не теряет инфективности. Если в течение этого срока дендритная клетка встречает Т-лимфоцит, то она передает ему хранимый вирус, причем делает это очень эффективно, так что в расчете на вирусную частицу инфективность вируса существенно увеличивается.

Для того, чтобы объяснить важность этого открытия, следует сначала рассказать немного о роли дендритных клеток в иммунном ответе.

Посмотрим на следующую картинку:



Дендритные клетки (показаны розовым слева) находятся на самой границе с внешним миром - либо прямо в эпидермисе, либо непосредственно под эпителием. Своими дендритами они захватывают чужеродные частицы (красные точки), проникнувшие в организм и даже более того - иногда они высовывают дендриты наружу и собирают частицы, находящиеся на поверхности слизистой. В случае появления большого количества чужеродных частиц они могут начать бить тревогу, выделяя цитокины, которые запускают у окружающих клеток антивирусные механизмы, а также привлекают и активируют нейтрофилов, макрофагов и Т клетки (так называемый врожденный иммунитет). Но основная функция дендритных клеток заключается в том, что они "переваривают" собранный мусор и перемещаются в периферийные лимфоузлы (структура в виде боба), в которых они показывают собранное незрелым лимфоцитам (в виде "перевареных" кусочков). Если лимфоцит реагирует на один из таких кусочков, то он активируется и начинает активно делиться, что ведет к адаптивному иммунному ответу. Зрелые лимфоциты выходят их лимфоузла и движутся на периферию, где они и подавляют инфекцию (правая часть картинки).

ВИЧ использует этот механизм для своих собственных целей. Непосредственно в эпидермисе очень мало его клеток-мишеней, CD4 лимфоцитов. Будучи захвачен дендритной клеткой через DC-SIGN он каким-то образом (точно еще не выяснено как) избегает "переваривания" и дожидается момента, когда дендритная клетка отнесет его в лимфоузел и из рук в руки передаст клетке-мишени. При такой передаче вирус оказывается вполтную прижат к CD4 лимфоциту, а потому имеет гораздо больше шансов проникнуть внутрь, чем если бы он сам связался с ней. Более того, лимфоциты на периферии обычно неактивированы, а потому представляют собой плохие мишени для вируса. В лимфоузле у вируса куда выше шансы встретить активированную клетку. Таким образом связывание с DC-SIGN играет очень важную роль в инициации ВИЧ инфекции.

Работая в лабе, я частенько пользовался дендритными клетками (или клеточными линиями экспрессирующими DC-SIGN) и эффект увеличения эффективности инфекции был очень существенным даже в клеточной культуре. Достаточно к лимфоцитам добавить 5-10% дендритных клеток для того чтобы титр вируса вырос в 10-30 раз.
shvarz: (Default)
В прошлом выпуске я писал о множественных особенностях белка оболочки ВИЧ, которые позволяют вирусу обходить иммунный ответ. Но является ли ВИЧ абсолютно неуязвимым для иммунного ответа? Сразу после инфекции количество вируса в крови быстро растет, но потом снижается в 10-100 раз по сравнению с пиковым количеством и после этого остается относительно постоянным. Для многих вирусов антитела являются очевидно важным фактором, контролирующим вирус в естественной инфекции или после вакцинации. Но в случае ВИЧ роль антител была под большим сомнением, хотя бы даже потому, что снижение количества вируса происходит гораздо раньше, чем появляются первые нейтрализующие антитела. В 1994 году Рик Кауп с соавторами показали, что снижение количества вируса совпадает по времени с появлением клеточного иммунного ответа, но многие были не убеждены в том, что между этими двумя факторам есть причинно-следственная связь и предполагали иные возможные причины - например, недостаток клеток мишеней для вируса.

В 1999 году Йорн Шмитц проделал элегантный эксперимент, который показал, что клеточный ответ действительно очень важен для контроля над ВИЧ. Он вводил обезьянам антитело, нацеленное на CD8+ клетки, заставляя иммунную систему уничтожать их. Через 30 минут после введения антитела количество CD8 клеток в крови макак падало почти до нуля, количество же остальных клеток иммунной системы не менялось. Если дополнительных инъекций антитела на делали, то количество CD8 клеток возвращалось к норме через 20-30 дней.
Сначала Шмитц удалил CD8 клетки перед тем, как заразить макак SIV. В этих обезьянах количество вируса росло как обычно, но потом не снижалось, а оставалось на пиковом уровне. Соответственно и к стадии СПИДа эти обезьяны приходили быстрее, чем обычно.
Затем антитело против CD8 было введено уже зараженным обезьянам, в которых количество вируса снизилось. Исчезновение CD8 клеток сопровождалось резким увеличением количества вируса в крови, которое возвращалось к норме лишь после того, как эффект анти-CD8 антитела кончался и CD8 клетки вновь появлялись в крови.

Таким образом была показана прямая связь между контролем вирусной инфекции и CD8 клетками.
shvarz: (Default)
Сегодняшний выпуск посвящен открытию, которое одновременно было помещено на обложку двух самых престижных научных журналов - Science и Nature (такое случается нечасто).

У ВИЧ единственный вирусный белок, который виден иммунной системе на поверхности вириона - это белок оболочки. Поэтому первые попытки сделать вакцину были нацелены именно на него. Но введение этого белка людям и подопытным животным не вызывало нужного иммунного ответа - вырабатывшиеся в ответ на него антитела не нейтрализовали вирус и первое большое клиническое испытание показало, что они не предотвращали инфекцию. Почему это так, стало понятно после работ в лаборатории Джо Содроски. Там пытались получить кристаллы белка оболочки, которые позволили бы узнать его структуру. Пытались долго и упорно, но кристаллы не образовывались. Дело в том, что для образования кристалла требуется более-менее стабильная форма белка, которая может повторяться в кристаллической матрице в одинаковой конфигурации. Про белок оболочки ВИЧ было известно, что во-первых, он весь обвешан олигосахарами, которые не имеют стабильной структуры, а во-вторых, имеет вариабельные участки, которые тоже очень нестабильны и не сворачиваются в стандартные альфа-спирали и бета-складки. Отсюда и проблемы с кристаллизацией.

Питер Квонг, студент в лаборатории Джозефа Содроски, наделал целую кучу вариантов белка оболочки ВИЧ, из которых он (во многом наугад) вырезал разные вариабельные куски и места крепления олигосахаров и после этого пытался получить кристаллы этих измененных белков. Конечно, такие изменения в последовательности белка могли изменить и его структуру, поэтому все варианты проверялись на функциональность - способность связываться с рецептором, с которым обычно связывается ВИЧ, и на распознование ВИЧ-специфичными антителами. Если структура белка менялась очень сильно, то он переставал связываться с рецептором и/или распозноваться антителами. Такие варианты сразу отбрасывались. И в итоге Питеру удалось получить кристаллы, да не просто белка оболочки, а в комплексе с рецептором и с антителом.

Полученная структура многое объяснила в свойствах белка оболочки. Было уже известно, что он является тримером, но в структуре стало видно, что все неизменные его части спрятаны глубоко в середине комплекса. Когда мономерный белок использовался в качестве вакцины, антитела, выработанные к этим неизменным частям, оказывались бесполезны, потому что в тримере на поверхности вируса эти части были спрятаны. Снаружи оставались лишь изменчивые петли, вырабатывать антитела к которым было бесполезно, потому что они не были важны для функции белка и вирус мог легко их изменять. Более того, множественные олигосахара оказались стратегически расположены на поверхности белка так, что предотвращали доступ к нему антител. Но как же связывание с рецептором? Ведь этот район функционально очень важен для вируса и должен располагаться на поверхности. На структуре было видно, что этот район построен в виде глубокой впадины в поверхности белка, которая часто меняет форму и лишь иногда приоткрывается для связывания с рецептором. После начального слабого связывания с рецептором, белок меняет форму на ту, которая позволяет более прочное связывание (так называемый induced fit). И уже эта форма способна распознать дополнительный ко-рецептор, который и используется вирусом для попадания в клетку. Постоянно меняющаяся конформация белка тоже служит защитой от антител, которые довольно специфчны в распознавании антигенов.

Так что эта структура, хотя она и не была полной структурой белка оболочки, многое объясняла в свойствах вируса и в том, почему первые попытки разработать вакцину были неудачными. И, конечно, давала надежду на то, что это знание позволит разработать эффективную вакцину. Как это водится, задача оказалась сложнее, чем ожидалось и реальную пользу в разработке вакцины эта структура начинает приносить лишь сейчас, тринадцать лет спустя. Питер Квонг вырос из студента в профессора и сейчас делает удивительные по красоте и смелости работы, в которых он манипулирует и перестраивает белок оболочки ВИЧ так, как ему угодно. Это позволило, например, ему с товарищами в прошлом году создать "приманку" на которую они выловили из некоторых ВИЧ пациентов нейтрализующие антитела очень широкого спектра действия.

А вот структуру полного немодифицированного белка оболочки с тех пор так получить и не удалось.
shvarz: (Default)
С появлением высоко-активной терапии (ВААРТ) стало возможным полностью подавлять вирусную репликацию в пациентах. Часть ученых предполагала, что если продержать пациента на терапии несколько лет, то можно будет полностью вылечить человека от ВИЧ, потому что вирус (или иммунная система) убъет все зараженные клетки, а терапия предотвратит появление новых. Но другие считали, что уничтожить вирус будет трудно, потому что было известно, что вирус заражал долгоживущие CD4 клетки иммунологической памяти. Разрешить этот спор могли лишь эксперименты.

Следующий текст был написан Дианой Финзи, которая в 1997 году была студенткой в лаборатории Роберта Силикано, и которая внесла большой вклад в открытие того, что вирус продолжает существовать в пациентах на ВААРТ (прим: я несколько сократил текст. ЕВ. оригинал здесь).

"Я хорошо помню этот день. Я знала, что проводить тест на присутствие вируса в крови было преждевременно, потому что отрицательный результат ничего бы не сказал нам. Однако положительный был бы неоспорим. Мне не терпелось и я решила провести анализ.

В то время я была студенткой в лаборатории Роберта Силикано в Университете Джона Хопкинса. Ранее мы разработали две методики для детекции вируса в крови пациентов. Обе методики показывали присутствие вируса в долгоживущих CD4 клетках. Методика культивации вируса требовала двадцать пробирок с кровью зараженных пациентов и примерно столько же крови от здоровых доноров, два дня напряженной работе по выделению клеток и месяц культивации.

Появление "коктейлей лекарств" придало нам оптимизма. Резкое снижение количества вируса в крови давало надежду, что после двух-трех лет терапии вирус исчезнет навсегда, если только он не сможет спрятаться в укромных местах организма. Мы знали, что долгоживующие клетки могут быть таким укромных уголком для вируса.

Доктора, лечившие пациентов, очень хотели узнать, может ли вирус прятаться в долгоживущих клетках и были рады дать нам образцы крови из своих пациентов. Мои коллеги и я мотались в Нью Йорк и в Германию за этими образцами, и возвращались в нашу маленькую лабораторию без окон в самое разное время суток, чтобы тут же начать выделение клеток из драгоценных образцов.

В тот день мы впервые тестировали кровь из пациентов принимающих ВААРТ, но мы ожидали, что результаты появятся лишь дней через десять. Стоя над чашкой с ELISA, я смотрела как голубеет жидкость в контрольных образцах. Мое внимание было привлечено к ячейкам с образцами пациентов, которые тоже начали голубеть. Присутствие вируса в этих ячейках означало бы, что долгоживущие CD4 клетки не были полностью свободны от вируса и что ВААРТ не привела к его уничтожению. Это означало бы, что эти клетки служат резервуаром ВИЧ и это бы давало очень плохой прогноз для ВИЧ-положительных пациентов.

Мой стол был самым ближним к офису Боба, но в тот день у него был посетитель и сначала я не хотела прерывать их беседу. Не веря своим глазам я смотрела на то, как карманы с образцами пациентов стали отчетливо голубыми, чувствуя одновременно грусть и важность этого результата. Может это ошибка? Загрязнение образцов? Повторить эксперимент? Или сразу сказать Бобу?

Я больше не могла ждать. Я прервала его встречу и попросила его посмотреть на результаты. Образцы были однозначно положительными и мы с Бобом стояли над ними повторяя раз за разом: "Неужели правда?" "Если это правда, то это очень плохо." "Но все-таки хорошо, что мы это выяснили."

Следующие несколько недель были полны тревогой и работой - мы повторяли эксперименты. Медленно, но верно приходили результаты. Мы нашли вирус в большинстве пациентов, и количество вируса, хотя и не большое, не уменьшалось с увеличением времени на терапии. Наши данные показывали, что пациенты на ВААРТ не были вылечены от ВИЧ и что им придется принимать терапию очень долго, возможно всю жизнь.

За последующие годы наши результаты были неоднократно подтверждены и у пациентов, которые бросали терапию, вирус в крови появлялся опять. Хотя возможно, что существуют и другие резервуары вируса, долгоживующие CD4 клетки являются наиболее изученным из них, и для излечения потребуется найти способ очистить их от вируса. Сейчас, 15 лет спустя, поиск способов уничтожения латентно-инфицированных клеток все еще продолжается."
shvarz: (Default)
Я не был на конференции IAS в Ванкувере в 1996 году, но говорят, что представленные на ней результаты высокоактивной терапии, основанной на приеме трех разных антивирусных препаратов, народ встретил стоя овацией (я такого никогда на научной конференции не видел). Результаты показывали полное подавление вируса, восстановление количества CD4 клеток, резкое снижение оппортунистических инфекций и смертей даже среди пациентов на последней стадии СПИДа.

Для нашей иcторической серии, однако, мы выбрали статью из совершенно иной области, почти не относящуюся к лечению или предотвращению ВИЧ, - генной терапии. Генная терапия, как об этом можно догадаться из самого названия, основана на том, что в клетки пациента вводят какой-то ген, который помогает ему справиться с болезнью. Например, мышечная дистрофия вызвана дефектом в гене дистрофин. Если в мышцы встроить нормальную копию этого гена, то они начинают расти нормально. Однако если просто синтезировать ген в виде молекулы ДНК и вколоть его в мышечную ткань, то эффективность его встраивания в мышечные клетки будет очень низкой. Поэтому для доставки генов используют вектора - вирусные частицы, которым вместо их собственного генетического материала подсовывают нужный ген.

Одна из проблем генной терапии заключается в том, что большая часть клеток в нашем организме довольно редко делятся, а это значит, что их генетический материал спрятан за ядерной оболочкой и недоступен для большинства векторов. Дидье Троно в 1996 году работал с ВИЧ и знал, что ВИЧ и родственные ему лентивирусы могут заражать неделящиеся клетки. Поэтому он решил попробовать использовать их в качестве векторов. Его лаборатория показала, что это отлично работает не только в клеточных культурах, но и в крысах, где им удалось ввести ген в нейроны головного мозга.

Сейчас лентивирусные вектора - одни из самых многообещающих для генной терапии. И даже уже были успехи в клинике - два года назад двух пациентов со смертельной болезнью мозга вылечили, взяв у них стволовые клетки крови, введя в них лентивирусным вектором ген ALD и пересадив их обратно пациентам. Сейчас проходит целый ряд клинических испытаний с использованием лентивирусных векторов.

Однако эта работа повлияла не только на генную терапию. В самых разных областях биологии рутинные эксперименты часто основаны на введении нужного гена в клетки. Лентивирусные вектора оказались чрезвычайно удобными для этих целей - в них очень просто встраивать нужный ген, их легко и быстро можно наработать в больших количествах, и после небольшой модификации они могут заражать самые разные виды клеток. Поэтому сейчас их можно найти в тысячах лабораторий по всему миру.
shvarz: (Default)
Если вы пропустили выпуск за 1993 год, то советую сначала прочитать его, потому что сегодня будет окончание той истории.

Итак, в 1994 году стало понятно, что ВИЧ инфекция, хотя и длится бессимптомно многие годы, не является классической латентной инфекцией, при которой вирус прячется где-то в организме выжидая ослабления иммунной системы для того, чтобы перейти в активное состояние. Панталео и Фаучи обнаружили, что в бессимптомной стадии вирус продолжает размножаться в лимфатических тканях и ведет к их воспалению и патологии. Марковиц и Хо, герои сегодняшнего выпуска, сделали количественную оценку этой репликации вируса.

Они рассуждали так: Мы наблюдаем более-менее постоянное и довольно большое количество вируса в крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Теория классической латентности предполагала, что эти вирусы были накоплены на ранней стадии инфекции, а иммунная система по какой-то причине не способна их вычистить. Но данные Панталео говорят, что вирус продолжает реплицироваться, так что возможно, что иммунная система вирусы вычищает, но их количество в крови регулярно пополняется новыми. Как узнать, с какой скоростью оно пополняется? Воспользуемся аналогией с бассейном, в который наливается вода и есть сток, но уровень воды остается постоянным. Очевидно, что в такой ситуации скорость наполнения бассейна равна скорости его опустошения. Посадив пациента на антиретровирусные лекарства мы можем полностью перекрыть наполняющий кран и тогда сможем измерить скорость стока, которая же будет равна и скорости наполнения.

Они измерили снижение количество вируса и инфицированных клеток в крови пациентов, только что начавших принимать терапию. И обнаружили удивительную вещь - период полураспада вируса в крови был всего несколько часов! А инфицированных клеток - около полутора дней! Это означало, что вирус в бессимптомной стадии не просто продолжает размножаться, как это открыли Панталео и Фаучи, но он продолжает размножаться очень и очень быстро, ежедневно инфицируя десятки тысяч клеток и производя сотни тысяч новых вирусных частиц.(pdf статьи)

До этого было известно всего два варианта развития вирусной инфекции: Либо вирус побеждал иммунную систему и человек умирал, либо иммунная система побеждала вирус. Во втором случае вирус мог быть полностью вычищен, а мог быть загнан в латентную форму, в которой он не мог принести большого вреда. ВИЧ инфекция оказалась третьим вариантом: При ней вирус и иммунная система долгое время находятся в патовой ситуации, при которой ни одна из сторон не может победить. И важно здесь даже не само патовое состояние, а то, что вирус оказался на это способен. Принцип адаптивной иммунной системы (соматические мутации с последующим селективным отбором и размножением реагирующих с патогеном клеток) считался непреодолимым для вирусов. Если вирусы и побеждали в инфекциях, то лишь захватив иммунную систему врасплох или используя какие-то баги в ее организации. ВИЧ же показал, что он может играть (и не проигрывать) на территории противника, мутируя и адаптируясь быстрее, чем иммунная система. И делать это настолько долго, насколько требуется для того, чтобы в конце концов победить ее.

Обычно считается, что вирусы находятся на узком пике фитнеса и мутации неминуемо ведут к серьезным дефектам в их способности размножаться. Об этом Марковиц и Хо не писали в своей статье, но их данные указывали на то, что ландшафт фитнеса ВИЧ является не остроконечным пиком, а скорее "столовой горой", так что он способен мутировать почти не меняя своей способности реплицироваться. Таким образом они подтверждали во многом гипотетическую до этого теорию "квазивидов" - то есть естественного отбора не индивидуальных последовательностей, а близкородственных популяций.
shvarz: (Default)
Большая часть вирусных инфекций длятся недолго, и после этого человек (если он не умер, а с инфекцией справился) остается иммунным к последующим инфекциям. Такие "природные эксперименты" помогают в разработке вакцин, предоставляя пример того, что требуется достичь в процессе вакцинации. Однако с ВИЧ это не работает - не известно ни одного случая, когда иммунная система человека полностью справилась бы с вирусом и человек бы приобрел иммунитет к ВИЧ. Но кое-что из наблюдений за естественными инфекциями узнать можно. В частности, в 1994 году было известно, что количество вируса вскоре после инфекции падает. Одна из теорий о том, почему это случается, предполагала, что иммунная система частично подавляет вирус. Если это так, то теоретически можно попробовать разобраться в том, как она это делает и не можем ли мы ее улучшить. Оппоненты этой теории указывали на то, что количество вируса снижается задолго до того, как начинают вырабатываться антитела против него, а значит причина снижения количества вируса заключается скорее всего в том, что вирус уничтожает большую часть клеток-мишеней и ему просто не в чем больше реплицироваться.

Рик Кауп с соавторами использовали очень сложный и трудоемкий в то время метод для того, чтобы проследить возникновение клеточного иммунного ответа при ВИЧ инфекции. И обнаружили, что его активация хорошо совпадает по времени со снижением количества вируса, таким образом подтвердив теорию о том, что иммунная система способна контролировать (до некоторой степени) репликацию ВИЧ.

Одним из последствий этого открытия стала идея о клеточной вакцине, которая не предотвращает ВИЧ инфекцию и не ведет к полному вычищению вируса, но стимулирует клеточный ответ таким образом, что он намного более эффективно подавляет вирус. То есть человек остается инфицированным на всю жизнь, но не болеет СПИДом и не передает вирус другим людям. О том, чем закончилась эта идея, будет написано выпусков через 10. А сейчас вернемся к Каупу и его комментарию, который он закончил так: "Когда мы опубликовали эту статью, мы думали, что мы разобрались в количественном измерении клеточного иммунитета, и что не пройдет и нескольких лет, как мы откроем все основные секреты ВИЧ-специфичного клеточного иммунитета. Джеф Сафрит, Брюс Уокер и я даже несколько расстроились по поводу того, что нам придется заниматься чем-то иным, поскольку в области ВИЧ изучать уже будет нечего. Как мы были не правы."

pdf статьи
Оригинал комментария Рика Каупа
shvarz: (Default)
В сегодняшнем выпуске - коротенькая статья (pdf), которая в комбинации с несколькими другими работами в 1993-95 годах, привела в итоге к одному из самых важных открытий о ВИЧ инфекции. Открытие это не только было важно для понимания патологии ВИЧ и развития СПИДа, но и послужило основой для разработки по настоящему эффективной антиретровирусной терапии. Более того - оно существенно изменило наши общие представления о вирусах и вирусных инфекциях. Но о том, что это было за открытие, я вам пока не скажу :) - придется подождать пару выпусков. А сегодня будет лишь первый шаг к нему.

ВИЧ относится к семейству лентивирусов. Lenti - на латыни означает "медленный". Известные еще до ВИЧ вирусы, отнесенные к этому семейству, были так названы, потому что между инфекцией и болезнью всегда проходило довольно много времени - это были "медленные" вирусы. ВИЧ не только генетически-родственен этим вирусам, но и совпадает по фенотипу - между инфекцией и наступлением иммунодефицита обычно проходит несколько лет. В 1993 году о том, что вирус находится в латентной стадии говорило и то, что количества вируса в крови были довольно небольшими и выделять вирус из здоровых пациентов было сложно (как оказалось впоследствии, это было в первую очередь связано с несовершенными методиками, но тогда об этом никто не знал). О механизмах хронических инфекций тогда было известно не очень много и обычно считалось, что вирус в этой латентной стадии почти не активен, не размножается и "прячется" где-то в организме с тем, чтобы выйти в удобный момент, как это делает, например, вирус герпеса. В отношении ВИЧ эта модель давала сбои. Например, устойчивость к антивирусным лекарствам - каким образом неактивный и нереплицирующийся вирус умудряется эволюционировать и адаптироваться к ним?

Подозревая, что стандартные модели латентности с ВИЧ могут не работать, Джепи Панталео и Тони Фаучи решили посмотреть на иммунную систему в общем здоровых ВИЧ-инфицированных пациентов. В биопсиях из лимфоузлов, а также и в лимфоидных тканях вроде тимуса они нашли куда большие количества вируса, чем в крови. И в них также наблюдались признаки воспаления и патологии. Таким образом, заключили авторы, "состояние классической микробиологической латентности не существует в ходе ВИЧ инфекции... ВИЧ активен и болезнь прогрессирует даже когда отсутствуют явно выраженные вирусные измерения в крови и наблюдается клиническая латентность."

Комментарий Фаучи и Пантелео

December 2013

S M T W T F S
1234567
891011121314
15161718192021
22232425262728
293031    

Syndicate

RSS Atom

Most Popular Tags

Style Credit

Expand Cut Tags

No cut tags
Page generated Sep. 24th, 2017 03:45 pm
Powered by Dreamwidth Studios